Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com.Vafraútgáfan sem þú notar hefur takmarkaðan CSS stuðning.Til að fá bestu upplifunina mælum við með því að þú notir uppfærðan vafra (eða slökkva á eindrægnistillingu í Internet Explorer).Í millitíðinni, til að tryggja áframhaldandi stuðning, munum við gera síðuna án stíla og JavaScript.
Toxoplasma gondii er innanfrumu frumdýrasníkjudýr sem mótar örumhverfi sýkta hýsilsins og vitað er að það tengist tíðni heilaæxlisvaxtar.Í þessari rannsókn gerum við þá tilgátu að exosomal miRNA-21 frá Toxoplasma sýkingu stuðli að vexti heilaæxla.Exosomes frá Toxoplasma-sýktum BV2 microglia voru einkennd og innvortis U87 glioma frumur var staðfest.Exosomal microRNA tjáningarsnið voru greind með því að nota fylki af microRNA og microRNA-21A-5p sem tengjast Toxoplasma gondii og æxlisflokkun.Við könnuðum einnig mRNA magn æxlistengdra gena í U87 glioma frumum með því að breyta miR-21 gildum í exosomes og áhrif exosomes á U87 glioma frumufjölgun.Í exósum U87 glioma frumna sem eru sýktar af Toxoplasma gondii eykst tjáning microRNA-21 og virkni æxlisgena (FoxO1, PTEN og PDCD4) minnkar.BV2-afleidd exósóm sýkt af Toxoplasma örva fjölgun U87 glioma frumna.Exosomes örva vöxt U87 frumna í músæxlislíkani.Við leggjum til að aukið exosomal miR-21 í Toxoplasma-sýktum BV2 microglia gæti gegnt mikilvægu hlutverki sem frumuvaxtarhvati í U87 glioma frumum með því að minnka æxlisgena.
Áætlað er að meira en 18,1 milljón tilfella af langt gengnu krabbameini hafi greinst um allan heim árið 2018, með um 297.000 æxli í miðtaugakerfi greind á hverju ári (1,6% allra æxla)1.Fyrri rannsóknir hafa sýnt að áhættuþættir fyrir þróun heilaæxla í mönnum eru ýmsar efnavörur, fjölskyldusaga og jónandi geislun frá höfuðmeðferðar- og greiningarbúnaði.Hins vegar er nákvæm orsök þessara illkynja sjúkdóma óþekkt.Um það bil 20% allra krabbameina um allan heim eru af völdum sýkinga, þar á meðal veira, baktería og sníkjudýra3,4.Smitandi sýklar trufla erfðakerfi hýsilfrumunnar, svo sem viðgerðir á DNA og frumuhringnum, og geta leitt til langvarandi bólgu og skemmda á ónæmiskerfinu5.
Smitefni sem tengjast krabbameini í mönnum eru algengustu veirusjúkdómsvaldarnir, þar á meðal papillomaveirur úr mönnum og lifrarbólgu B og C veirur.Sníkjudýr geta einnig gegnt hugsanlegu hlutverki í þróun krabbameins í mönnum.Nokkrar tegundir sníkjudýra, nefnilega Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis og Hymenolepis nana, hafa verið bendlaðir við ýmsar tegundir krabbameins í mönnum 6,7,8.
Toxoplasma gondii er innanfrumu frumdýr sem stjórnar örumhverfi sýktra hýsilfrumna.Talið er að þetta sníkjudýr smiti um það bil 30% jarðarbúa, sem setur alla íbúa í hættu9,10.Toxoplasma gondii getur sýkt lífsnauðsynleg líffæri, þar á meðal miðtaugakerfið (CNS), og valdið alvarlegum sjúkdómum eins og banvænum heilahimnubólgu og heilabólgu, sérstaklega hjá ónæmisbældum sjúklingum9.Hins vegar getur Toxoplasma gondii einnig breytt umhverfi sýkta hýsilsins með því að stilla frumuvöxt og ónæmissvörun hjá ónæmishæfum einstaklingum, sem leiðir til þess að viðhalda einkennalausri langvinnri sýkingu9,11.Athyglisvert er að miðað við fylgni á milli T. gondii algengi og tíðni heilaæxla, benda sumar skýrslur til þess að umhverfisbreytingar í hýsli í lífi vegna langvarandi T. gondii sýkingar líkist örumhverfi æxlis.
Exósóm eru þekkt sem millifrumumiðlar sem skila líffræðilegu innihaldi, þar með talið próteinum og kjarnsýrum, frá nálægum frumum16,17.Exósóm geta haft áhrif á æxlistengda líffræðilega ferla eins og andstæðingur frumudauða, æðamyndun og meinvörp í örumhverfi æxlis.Sérstaklega eru miRNAs (miRNAs), lítil RNA sem ekki eru kóðað, um 22 núkleótíð að lengd, mikilvægir genastýringar eftir umritun sem stjórna meira en 30% af mRNA manna í gegnum miRNA-framkallaða þagnarkomplex (miRISC).Toxoplasma gondii getur truflað líffræðilega ferla með því að stjórna tjáningu miRNA í sýktum hýslum.MiRNA hýsils innihalda mikilvæg merki til að stjórna líffræðilegum ferlum hýsilsins til að ná fram lifunarstefnu sníkjudýrsins.Þannig getur rannsókn á breytingum á hýsils miRNA prófílnum við sýkingu með T. gondii hjálpað okkur að skilja samskipti hýsilsins og T. gondii betur.Reyndar, Thirugnanam o.fl.15 bentu til þess að T. gondii ýti undir krabbameinsmyndun í heila með því að breyta tjáningu þess á sérstökum hýsilmiRNA sem tengjast æxlisvexti og fann að T. gondii getur valdið glioma í tilraunadýrum.
Þessi rannsókn beinist að breytingu á exosomal miR-21 í hýsilmíkróglum sem sýktir eru af Toxoplasma BV2.Við sáum hugsanlegt hlutverk breytts utanaðkomandi miR-21 í vexti U87 glioma frumna vegna varðveislu í kjarna FoxO1/p27, sem er markmið oftjáðs miR-21.
Exósóm úr BV2 voru fengin með mismunaskilvindu og staðfest með ýmsum aðferðum til að koma í veg fyrir mengun með frumuhlutum eða öðrum blöðrum.SDS-pólýakrýlamíð hlaup rafskaut (SDS-PAGE) sýndi sérstakt mynstur á milli próteina sem dregin voru út úr BV2 frumum og exósóma (Mynd 1A), og sýni voru metin með tilliti til nærveru Alix, sem var greint með Western blotting á exosomal próteinmerkjum í .Alix merking fannst í exosome próteinum en ekki í BV2 frumu lysate próteinum (Mynd 1B).Að auki var hreinsað RNA úr exósómum úr BV2 greint með því að nota lífgreiningartæki.18S og 28S ríbósóma undireiningar sáust sjaldan í utanaðkomandi RNA flæðimynstri, sem gefur til kynna áreiðanlegan hreinleika (Mynd 1C).Að lokum sýndi rafeindasmásjárgreiningar að fram komnar exosomes voru um 60-150 nm að stærð og höfðu bolla-eins byggingu dæmigerð fyrir exosome formgerð (Mynd 1D).
Einkenni exósóma úr BV2 frumum.(A) Öryggisblaðsíða.Prótein voru einangruð úr BV2 frumum eða exósóm úr BV2.Próteinmynstur eru mismunandi milli frumna og exósóma.(B) Western blot greining á exosomal marki (Alix).(C) Mat á hreinsuðu RNA úr BV2 frumum og BV2 afleiddum exósómum með því að nota lífgreiningartæki.Þannig fundust sjaldan 18S og 28S ríbósómal undireiningar í BV2 frumum í utanaðkomandi RNA.(D) Sendingarrafeindasmásjárskoðun sýndi að exósóm einangruð frá BV2 frumum voru neikvætt lituð með 2% úranýl asetati.Exosomes eru um það bil 60-150 nm að stærð og bollalaga (Song og Jung, óbirt gögn).
Innbyrðis frumumyndun á BV2-afleiddum exósómum í U87 manna glioma frumur sást með því að nota confocal smásjá.PKH26 merkt exósóm eru staðbundin í umfrymi U87 frumna.Kjarnar voru litaðir með DAPI (mynd 2A), sem gefur til kynna að BV2-afleidd exósóm geta verið innbyrðis af hýsilfrumum og haft áhrif á umhverfi viðtökufrumna.
Innbygging á BV2-afleiddum exósómum í U87 glioma frumur og BV2-fengnar exosomes sýktar af Toxoplasma RH olli fjölgun U87 glioma frumna.(A) Exosomes gleypa af U87 frumum mæld með confocal smásjá.U87 glioma frumur voru ræktaðar með exósómum merktum PKH26 (rauðu) eða án viðmiðunar í 24 klukkustundir.Kjarnarnir voru litaðir með DAPI (bláum) og síðan skoðaðir í samfókus smásjá (kvarðastöng: 10 μm, x 3000).(B) U87 glioma frumufjölgun var ákvörðuð með frumufjölgunargreiningu.U87 glioma frumur voru meðhöndlaðar með exosomes í tilgreindan tíma. *P < 0,05 fékkst með t prófi nemenda. *P < 0,05 fékkst með t prófi nemenda. *P < 0,05 hæð fyrir t-критерию Стьюдента. *P < 0,05 samkvæmt t-prófi nemenda. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 fengin með t-prófi nemenda.
Eftir að hafa staðfest innbyrðis innleiðingu BV2-afleiddra exósóma í U87 glioma frumur, gerðum við frumufjölgunarprófanir til að kanna hlutverk BV2-afleiddra Toxoplasma-afleiddra exósóma í þróun manna glioma frumur.Meðferð á U87 frumum með exósómum frá T. gondii sýktum BV2 frumum sýndi að T. gondii sýktar BV2 afleiddar exósóm olli marktækt meiri fjölgun U87 frumna samanborið við samanburðarhóp (mynd 2B).
Að auki hafði vöxtur U118 frumna sömu niðurstöður og U87, þar sem Toxoplasma örvuð exósóm olli hæstu stigum fjölgunar (gögn ekki sýnd).Byggt á þessum gögnum getum við gefið til kynna að BV2-afleidd Toxoplasma-sýkt exósóm gegni mikilvægu hlutverki í glioma frumufjölgun.
Til að kanna áhrif Toxoplasma-sýktra BV2-afleiddra exósóma á æxlisþróun, sprautuðum við U87 glioma frumum í naktar mýs fyrir xenograft líkan og sprautuðum BV2-afleiddum exósómum eða RH-sýktum BV2-afleiddum exósómum.Eftir að æxli komu í ljós eftir 1 viku var hverjum tilraunahópi af 5 músum skipt eftir æxlisstærð til að ákvarða sama upphafspunkt og æxlisstærð mæld í 22 daga.
Hjá músum með U87 xenograft líkanið sást marktækt stærri æxlisstærð og þyngd í BV2-afleiddum RH-sýktum exosome hópnum á degi 22 (mynd 3A,B).Á hinn bóginn var enginn marktækur munur á æxlisstærð milli BV2-afleiddra exosome hópsins og samanburðarhópsins eftir exosome meðferð.Að auki sýndu mýs sem voru sprautaðar með glioma frumum og exosomes sjónrænt stærsta æxlisrúmmálið í hópi RH-sýktra BV2-afleiddra exósóma (mynd 3C).Þessar niðurstöður sýna fram á að BV2-afleidd Toxoplasma-sýkt exósóm framkalla glioma vöxt í músæxlislíkani.
Oncogenesis (AC) af BV2-afleiddum exosomes í U87 xenograft mús líkani.Æxlisstærð (A) og þyngd (B) jukust marktækt í BALB/c naktum músum sem voru meðhöndlaðar með RH-sýktum exósómum úr BV2.BALB/c naktum músum (C) var sprautað undir húð með 1 x 107 U87 frumum sviflausnar í Matrigel blöndu.Sex dögum eftir inndælingu voru 100 μg af BV2-afleiddum exósómum meðhöndluð í músum.Æxlisstærð og þyngd voru mæld á tilgreindum dögum og eftir fórn, í sömu röð. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05.
Gögnin sýndu að 37 miRNAs (16 oftjáð og 21 niðurtjáð) tengd ónæmi eða æxlisþróun voru marktækt breytt í microglia eftir sýkingu með Toxoplasma RH stofninum (mynd 4A).Hlutfallslegt tjáningarmagn miR-21 meðal breyttra miRNAs var staðfest með rauntíma RT-PCR í exósómum úr BV2, exósómum meðhöndlaðir með BV2 og U87 frumum.Tjáning miR-21 sýndi marktæka aukningu á exosomes frá BV2 frumum sýktar af Toxoplasma gondii (RH stofn) (Mynd 4B).Hlutfallslegt tjáningarmagn miR-21 í BV2 og U87 frumum jókst eftir upptöku breyttra exósóma (mynd 4B).Hlutfallslegt magn miR-21 tjáningar í heilavef æxlissjúklinga og músa sem sýktar voru af Toxoplasma gondii (ME49 stofni) voru hærri en í samanburðarhópi (mynd 4C).Þessar niðurstöður tengjast mismun á tjáningarstigum spáðra og staðfestra microRNAs in vitro og in vivo.
Breytingar á tjáningu exosomal miP-21a-5p í microglia sýkt af Toxoplasma gondii (RH).(A) Sýnir verulegar breytingar á siRNA sem tengjast ónæmi eða æxlisþróun eftir T. gondii RH sýkingu.(B) Hlutfallslegt miR-21 tjáningarstig greindist með rauntíma RT-PCR í BV2-afleiddum exósómum, BV2-meðhöndluðum exósómum og U87 frumum.(C) Hlutfallslegt miR-21 tjáningarstig fundust í heilavef æxlissjúklinga (N=3) og músa sem sýktar voru af Toxoplasma gondii (ME49 stofni) (N=3). *P < 0,05 fékkst með t prófi nemenda. *P < 0,05 fékkst með t prófi nemenda. *P < 0,05 hæð með t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 fékkst með því að nota t-próf ​​nemenda. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 fengin með t-prófi nemenda.
Exosomes frá RH-sýktum BV2 frumum leiddu til vaxtar glioma in vivo og in vitro (Mynd 2, 3).Til að greina viðeigandi mRNA, skoðuðum við mRNA-magn æxlismarkgena, forkhead box O1 (FoxO1), PTEN og forritaðan frumudauða 4 (PDCD4) í U87 frumum sem voru sýktar af exósómum úr BV2 eða RH BV2.Lífupplýsingagreining hefur sýnt að nokkur æxlistengd gen, þar á meðal FoxO1, PTEN og PDCD4 genin, hafa miR-2121,22 bindistaði.mRNA-magn æxlismarkgena minnkaði í RH-sýktum BV2-afleiddum exósómum samanborið við BV2-afleidda exósóma (mynd 5A).FoxO1 sýndi minnkað próteinmagn í RH-sýktum BV2-afleiddum exósómum samanborið við BV2-afleidda exósóm (Mynd 5B).Byggt á þessum niðurstöðum gætum við staðfest að exósóm sem eru unnin úr RH-sýktum BV2 lækka krabbameinsvaldandi gena og viðhalda hlutverki sínu í æxlisvexti.
Toxoplasma RH-sýkt BV2-afleidd exósóm örva bælingu æxlisgena í U87 glioma frumum með Toxoplasma RH-sýktum BV2-afleiddum exósómum.(A) Rauntíma PCR af FoxO1, PTEN og PDCD4 tjáningu í exósómum úr T. gondii RH-sýktum BV2 samanborið við PBS exosomes.β-aktín mRNA var notað sem viðmið.(B) FoxO1 tjáning var ákvörðuð með Western blotting og þéttnimælingargögn voru tölfræðilega metin með því að nota ImageJ forritið. *P < 0,05 fékkst með t prófi nemenda. *P < 0,05 fékkst með t prófi nemenda. *P < 0,05 hæð með t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 fékkst með því að nota t-próf ​​nemenda. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 fengin með t-prófi nemenda.
Til að skilja áhrif miP-21 í exósómum á æxlistengda genastjórnun, voru U87 frumur sýktar með hemli á miP-21 með því að nota Lipofectamine 2000 og frumurnar voru safnaðar 24 tímum eftir flutning.Tjáningarmagn FoxO1 og p27 í frumum sem voru umbreyttar með miR-21 hemlum voru bornar saman við frumur sem voru meðhöndlaðar með BV2-afleiddum exósómum með því að nota qRT-PCR (mynd 6A, B).Flutningur miR-21 hemils inn í U87 frumur dró verulega úr tjáningu FoxO1 og p27 (Mynd 6).
RH-sýkt exosomal BV2-afleidd miP-21 breytti FoxO1/p27 tjáningu í U87 glioma frumum.U87 frumur voru transsýktar með miP-21 hemli með því að nota Lipofectamine 2000 og frumur voru safnaðar 24 klukkustundum eftir transfektion.Tjáningarmagn FoxO1 og p27 í frumum sem voru transsýktar með miR-21 hemlum voru bornar saman við gildi í frumum sem voru meðhöndlaðar með BV2-afleiddum exósómum með qRT-PCR (A, B).
Til að komast undan ónæmissvörun hýsilsins umbreytist Toxoplasma sníkjudýrið í vefjablöðru.Þeir sníkja ýmsa vefi, þar á meðal heila, hjarta og beinagrindarvöðva, allan líftíma hýsilsins og móta ónæmissvörun hýsilsins.Að auki geta þeir stjórnað frumuhringnum og frumudreifingu hýsilfrumna og stuðlað að útbreiðslu þeirra14,24.Toxoplasma gondii sýkir aðallega tannfrumur hýsils, daufkyrninga og einfrumu/átfrumna ætterni, þar með talið heilaörn.Toxoplasma gondii framkallar aðgreiningu átfrumna af M2 svipgerðinni, hefur áhrif á sársheilun eftir sýkingu af völdum sýkingar og tengist einnig ofæðamyndun og kyrningamyndun.Þessi hegðunarsjúkdómur af Toxoplasma sýkingu getur tengst merkjum sem tengjast æxlisþróun.Fjandsamlegt umhverfi sem stjórnað er af Toxoplasma getur líkst samsvarandi forkrabbameini.Því má gera ráð fyrir að Toxoplasma sýking eigi að stuðla að þróun heilaæxla.Reyndar hefur verið tilkynnt um há tíðni Toxoplasma sýkingar í sermi sjúklinga með ýmis heilaæxli.Að auki getur Toxoplasma gondii verið annar krabbameinsvaldandi áhrifavaldur og virkað á samverkandi hátt til að hjálpa öðrum smitandi krabbameinsvaldandi efnum að þróa heilaæxli.Í þessu sambandi er rétt að taka fram að P. falciparum og Epstein-Barr veira stuðla samverkandi að myndun Burkitt eitilæxli.
Hlutverk exósóma sem eftirlitsaðila á sviði krabbameinsrannsókna hefur verið mikið rannsakað.Hins vegar er hlutverk exósóma milli sníkjudýra og sýktra hýsils enn illa skilið.Hingað til hafa ýmsir eftirlitsaðilar, þar á meðal seytt prótein, útskýrt líffræðilega ferla þar sem frumdýrasníkjudýr standast árás hýsils og viðhalda sýkingu.Nýlega hefur verið vaxandi hugmynd um að frumdýratengdar örblöðrur og microRNA þeirra hafi samskipti við hýsilfrumur til að skapa hagstætt umhverfi til að lifa af.Þess vegna er þörf á frekari rannsóknum til að uppgötva tengslin á milli breyttra miRNA í utanaðkomandi umhverfi og útbreiðslu glioma frumna.MicroRNA breyting (þyrpingargen miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 og miR-17-92) binst STAT3-hvatanum í toxoplasma-sýktum átfrumum manna, er stjórnað og framkallar andstæðingur -apoptosis sem svar við Toxoplasma gondii sýkingu 29 .Toxoplasma sýking eykur tjáningu miR-17-5p og miR-106b-5p, sem tengjast nokkrum offjölgunarsjúkdómum 30 .Þessar upplýsingar benda til þess að miRNA hýsils sem stjórnað er af Toxoplasma sýkingu séu mikilvægar sameindir fyrir lifun sníkjudýra og meingerð í líffræðilegri hegðun hýsilsins.
Breytt miRNA getur haft áhrif á ýmsar gerðir af hegðun við upphaf og framgang illkynja frumna, þar með talið glioma: sjálfsbjargarviðleitni vaxtarmerkja, ónæmi fyrir vaxtarhamlandi merkjum, undanskot frá apoptosis, ótakmarkaðan fjölgunarmöguleika, æðamyndun, innrás og meinvörp og bólga.Í glioma hafa breytt miRNAs verið auðkennd í nokkrum tjáningarprófunarrannsóknum.
Í þessari rannsókn staðfestum við mikið magn af miRNA-21 tjáningu í toxoplasma-sýktum hýsilfrumum.miR-21 hefur verið skilgreint sem eitt algengasta oftjáða microRNA í föstum æxlum, þar á meðal glioma, 33 og tjáning þess er í samræmi við gráðu glioma.Safnaðar vísbendingar benda til þess að miR-21 sé nýtt krabbameinsgen sem virkar sem and-apoptótísk þáttur í vöxt glioma og er mjög oftjáður í vefjum og plasma illkynja sjúkdóma í heila.Athyglisvert er að miR-21 óvirkjun í glioma frumum og vefjum kveikir á hömlun á frumufjölgun vegna kaspasaháðrar frumudauða.Lífupplýsingagreining á miR-21 spáðum markmiðum leiddi í ljós mörg æxlisbælandi gen tengd frumudauðaferlum, þar á meðal forritaðan frumudauða 4 (PDCD4), tropomyosin (TPM1), PTEN og forkhead box O1 (FoxO1), með miR-2121 bindistaðnum..22.38.
FoxO1, sem einn af umritunarþáttunum (FoxO), tekur þátt í þróun ýmissa tegunda krabbameins í mönnum og getur stjórnað tjáningu æxlisbælandi gena eins og p21, p27, Bim og FasL40.FoxO1 getur bundið og virkjað frumuhringshemla eins og p27 til að bæla frumuvöxt.Þar að auki er FoxO1 lykiláhrifavaldur PI3K/Akt merkja og stjórnar mörgum líffræðilegum ferlum eins og framvindu frumuhrings og frumuaðgreiningar með virkjun p2742 umritunar.
Að lokum teljum við að exosomal miR-21, sem er unnið úr Toxoplasma-sýktum microglia, geti gegnt mikilvægu hlutverki sem vaxtarstillir glioma frumur (Mynd 7).Hins vegar er þörf á frekari rannsóknum til að finna bein tengsl milli exosomal miR-21, breyttrar Toxoplasma sýkingar og vaxtar glioma.Búist er við að þessar niðurstöður verði upphafspunktur til að rannsaka sambandið milli Toxoplasma sýkingar og tíðni glioma.
Skýringarmynd af ferli krabbameinsmyndunar glioma (heila) er lögð til í þessari rannsókn.Höfundur teiknar í PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Allar tilraunareglur í þessari rannsókn, þar á meðal notkun dýra, voru í samræmi við Seoul National University Animal Care and User Committee staðlaðar siðferðisreglur og voru samþykktar af Institutional Review Board of Seoul National University School of Medicine (IRB númer SNU- 150715).-2).Allar tilraunaaðgerðir voru framkvæmdar í samræmi við ráðleggingar ARRIVE.
BV2 músaörnfrumur og U87 gliómfrumur úr mönnum voru ræktaðar í Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seoul, Kóreu) og Roswell Park Memorial Institute's Medium (RPMI; Welgene), hver um sig, hver um sig innihélt 10% fóstursermi nautgripa, 4 mM l- glútamín, 0,2 mM penicillín og 0,05 mM streptómýsín.Frumur voru ræktaðar í hitakassa með 5% CO2 við 37°C.Önnur glioma frumulína, U118, var notuð til samanburðar við U87 frumur.
Til að einangra exósóm frá T. gondii sýktum RH og ME49 stofnum voru T. gondii tachyzoites (RH stofn) safnað úr kviðarholi 6 vikna gamalla BALB/c músa sem sprautaðar voru 3-4 dögum áður.Tachyzoites voru þvegin þrisvar sinnum með PBS og hreinsuð með skilvindu í 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43.Til að fá tachyzoites af stofni ME49 var BALB/c músum sprautað í kviðarhol með 20 vefjablöðrum og tachyzoite umbreytingu í blöðrum var safnað með því að þvo kviðarholið á 6-8 degi eftir sýkingu (PI).Mýs sýktar af PBS.ME49 tachyzoites voru ræktuð í frumum með 100 μg/ml penicillíni (Gibco/BRL, Grand Island, NY, Bandaríkjunum), 100 μg/ml streptomycin (Gibco/BRL) og 5% fóstursermi frá nautgripum (Lonza, Walkersville, MD) .., USA) við 37 °C og 5% koltvísýring.Eftir ræktun í Vero frumum voru ME49 tachyzoites flutt tvisvar í gegnum 25 gauge nál og síðan í gegnum 5 µm síu til að fjarlægja rusl og frumur.Eftir þvott voru tachyzoites endurblönduð í PBS44.Vefblöðrum af Toxoplasma gondii stofni ME49 var viðhaldið með inndælingu í kviðarholi á blöðrum einangruðum úr heila sýktra C57BL/6 músa (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Kóreu).Heili ME49 sýktra músa var safnað eftir 3 mánaða PI og hakkað undir smásjá til að einangra blöðrur.Sýktum músum var haldið undir sérstökum sjúkdómsvaldandi skilyrðum (SPF) við Seoul National University School of Medicine.
Heildar-RNA var dregið úr BV2-afleiddum exósum, BV2 frumum og vefjum með því að nota miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Þýskalandi) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda, þar á meðal ræktunartíma fyrir skolunarþrepið.Styrkur RNA var ákvarðaður á NanoDrop 2000 litrófsmæli.Gæði RNA örfylkja voru metin með því að nota Agilent 2100 lífgreiningartæki (Agilent Technologies, Amstelveen, Hollandi).
DMEM með 10% exosome-lélegu FBS var útbúið með örskilvindu við 100.000g í 16 klukkustundir við 4°C og síað í gegnum 0,22 µm síu (Nalgene, Rochester, NY, USA).BV2 frumur, 5 × 105, voru ræktaðar í DMEM sem innihéldu 10% exósóm-snautt FBS og 1% sýklalyf við 37°C og 5% CO2.Eftir 24 klst. ræktun var tachyzoites af stofni RH eða ME49 (MOI = 10) bætt við frumurnar og sníkjudýr sem ekki réðust inn voru fjarlægð innan klukkustundar og fyllt aftur með DMEM.Exósóm frá BV2 frumum voru einangruð með breyttri mismunaskilvindu, sem er mest notaða aðferðin.Resuspendið exosome kögglan í 300 µl PBS fyrir RNA eða próteingreiningu.Styrkur einangraðra exósóma var ákvarðaður með því að nota BCA próteinprófunarbúnað (Pierce, Rockford, IL, USA) og NanoDrop 2000 litrófsmæli.
Botnfall úr BV2 frumum eða exósóm úr BV2 var leyst í PRO-PREP™ próteinútdráttarlausn (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Kóreu) og próteinum var hlaðið á Coomassie brilliant blue lituð 10% SDS pólýakrýlamíð hlaup.Að auki voru prótein flutt yfir á PVDF himnur í 2 klst.Western blot voru staðfest með því að nota Alix mótefni (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) sem utanaðkomandi merki.HRP-tengd geit-and-mús IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, Bandaríkjunum) og LAS-1000 plús sjálflýsandi myndgreiningartæki (Fuji Photographic Film, Tokyo, Japan) voru notuð sem aukamótefni..Sendingarrafeindasmásjárskoðun var gerð til að rannsaka stærð og formgerð exósóma.Exósóm einangruð úr BV2 frumum (6,40 µg/µl) voru útbúin á kolefnishúðuðum möskvum og neikvætt lituð með 2% úranýl asetati í 1 mín.Tilbúin sýni sáust við 80 kV hröðunarspennu með því að nota JEOL 1200-EX II (Tokyo, Japan) búin ES1000W Erlangshen CCD myndavél (Gatan, Pleasanton, CA, Bandaríkjunum).
BV2-afleidd exósóm voru lituð með því að nota PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Bandaríkjunum) í 15 mínútur við stofuhita.U87 frumur, 2×105, með PKH26 merktum exósómum (rauðum) eða engum exósómum sem neikvæðum samanburði, voru ræktaðar við 37°C í 24 klukkustundir í 5% CO2 útungunarvél.U87 frumukjarnar voru litaðir með DAPI (bláum), U87 frumur voru festar í 4% paraformaldehýði í 15 mínútur við 4°C og síðan greindar í Leica TCS SP8 STED CW confocal smásjákerfi (Leica Microsystems, Mannheim, Þýskalandi).sjáanlegt.
cDNA var búið til úr siRNA með því að nota Mir-X siRNA fyrstu strengsmyndun og SYBR qRT-PCR Kit (Takara Bio Inc., Shiga, Japan).Rauntíma megindleg PCR var framkvæmd með því að nota iQ5 rauntíma PCR greiningarkerfið (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) með því að nota grunnar og sniðmát blandað með SYBR Premix.DNA var magnað upp í 40 hringi af eðlisbreytingu við 95°C í 15 sekúndur og blöndun við 60°C í 60 sek.Gögnin frá hverri PCR viðbrögðum voru greind með því að nota gagnagreiningareiningu iQ™5 ljóskerfishugbúnaðarins (Bio-Rad).Hlutfallslegar breytingar á genatjáningu milli valinna markgena og β-aktín/siRNA (og U6) voru reiknaðar út með stöðluðu ferlinum.Grunnraðirnar sem notaðar eru eru sýndar í töflu 1.
3 x 104 U87 glioma frumur voru sáð í 96-brunna plötur og blandað saman við Toxoplasma sýkta exósóm úr BV2 (50 μg/mL) eða nonpulse exosomes úr BV2 (50 μg/mL) sem viðmið eftir 12, 18 og 36 klst. .Frumufjölgunarhraði var ákvarðaður með því að nota frumutalningarsett-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) (viðbótarmyndir S1-S3) 46 .
5 vikna gamlar kvenkyns BALB/c naktar mýs voru keyptar frá Orient Bio (Seongnam-si, Suður-Kóreu) og þær geymdar hver fyrir sig í dauðhreinsuðum búrum við stofuhita (22±2°C) og rakastig (45±15°C).%) við stofuhita (22±2°C) og rakastig (45±15%).12 klukkustunda ljós lota og 12 klukkustunda dökk lota voru framkvæmd undir SPF (Seoul National University School of Medicine Animal Center).Músum var skipt af handahófi í þrjá hópa af 5 músum hver og öllum hópum var sprautað undir húð með 400 ml af PBS sem innihélt 1 x 107 U87 glioma frumur og vaxtarþáttarskerðingu BD Matrigel™ (BD Science, Miami, FL, Bandaríkjunum).Sex dögum eftir æxlisinndælingu var 200 mg af exósómum úr BV2 frumum (með/án Toxoplasma sýkingar) sprautað inn á æxlisstaðinn.Tuttugu og tveimur dögum eftir æxlissýkingu var æxlisstærð músa í hverjum hópi mæld með vog þrisvar í viku og æxlisrúmmálið reiknað með formúlunni: 0,5×(breidd)×2×lengd.
MicroRNA tjáningargreining með því að nota miRCURYTM LNA miRNA fylki, 7. kynslóð hefur, mmu og rno fylki (EXIQON, Vedbaek, Danmörk) sem nær yfir 1119 vel einkenndar mýs meðal 3100 manna, músa og rotta miRNA fangarannsókna.Meðan á þessari aðferð stóð voru 250 til 1000 ng af heildar-RNA fjarlægð úr 5'-fosfatinu með meðhöndlun með basískum fosfatasa í þörmum kálfa og síðan merkt með Hy3 grænum flúrljómandi litarefni.Merktu sýnin voru síðan blönduð með því að hlaða örfylkisglærum með því að nota blendingarklefasett (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) og blendingarskyggnusett (Agilent Technologies).Blöndun var framkvæmd í 16 klukkustundir við 56°C, síðan voru örfylkin þvegin í samræmi við ráðleggingar framleiðanda.Unnu örfylkisglærurnar voru síðan skannaðar með því að nota Agilent G2565CA örfylkisskannakerfi (Agilent Technologies).Skannaðar myndir voru fluttar inn með Agilent Feature Extraction hugbúnaðarútgáfu 10.7.3.1 (Agilent Technologies) og flúrljómunarstyrkur hverrar myndar var magnmældur með samsvarandi GAL skrá af breyttu Exiqon samskiptareglunum.Örfylkisgögn fyrir núverandi rannsókn eru geymd í GEO gagnagrunninum undir aðgangsnúmeri GPL32397.
Tjáningarsnið á þroskuðum exosomal miRNAs í microglia af RH eða ME49 stofnum sýktum af Toxoplasma voru greind með ýmsum netverkfærum.miRNA sem tengdust æxlisþróun voru auðkennd með því að nota miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) og síuð út með eðlilegum merkistyrk (log2) sem var meiri en 8,0.Meðal miRNAs reyndust mismunað tjáð miRNAs vera meira en 1,5-falt breytt með síugreiningu á miRNA sem breytt var af RH eða ME49 stofnum sem voru sýktir af T. gondii.
Frumum var sáð í sex brunna plötur (3 x 105 frumur/brunn) í opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA) með því að nota Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).Transsýktu frumurnar voru ræktaðar í 6 klukkustundir og síðan var miðlinum breytt í ferskt fullkomið miðil.Frumur voru teknar 24 klukkustundum eftir flutning.
Tölfræðileg greining var aðallega gerð með t-prófi Student með Excel hugbúnaði (Microsoft, Washington, DC, Bandaríkjunum).Fyrir tilraunadýragreiningu var tvíhliða ANOVA gerð með Prism 3.0 hugbúnaði (GraphPad Software, La Jolla, CA, Bandaríkjunum). P-gildi < 0,05 voru talin tölfræðilega marktæk. P-gildi < 0,05 voru talin tölfræðilega marktæk. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P gildi <0,05 voru talin tölfræðilega marktæk. P 值< 0.05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P gildi <0,05 voru talin tölfræðilega marktæk.
Allar tilraunasamskiptareglur sem notaðar voru í þessari rannsókn voru samþykktar af Institutional Review Board Seoul National University School of Medicine (IRB númer SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. o.fl.Áætluð alþjóðleg krabbameinstíðni og dánartíðni árið 2018: GLOBOCAN heimildir og aðferðir.Túlkun.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Innsýn í áhættuþætti heilaæxla og meðferðarúrræði þeirra. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Innsýn í áhættuþætti heilaæxla og meðferðarúrræði þeirra.Rashid, S., Rehman, K. og Akash, MS Yfirlit yfir áhættuþætti fyrir heilaæxli og meiriháttar meðferðaraðgerðir. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Djúpur skilningur á áhættuþáttum heilaæxla og meðferðarúrræði.Rashid, S., Rehman, K. og Akash, MS Yfirlit yfir áhættuþætti fyrir heilaæxli og meiriháttar meðferðaraðgerðir.Lífeðlisfræði.Lyfjafræðingur.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakteríu-veiru milliverkanir í krabbameini í meltingarvegi og kvenkyns kynfærum: Samantekt á faraldsfræðilegum og rannsóknarstofum. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakteríu-veiru milliverkanir í krabbameini í meltingarvegi og kvenkyns kynfærum: Samantekt á faraldsfræðilegum og rannsóknarstofum.Kato I., Zhang J. og Sun J. Bakteríu-veiru milliverkanir í krabbameini í meltingarvegi manna og kynfærum kvenna: samantekt á faraldsfræðilegum og rannsóknarstofugögnum. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J.据总结. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakteríu-veiruvíxlverkun í meltingu í munnholi manna og æxlunarfæri kvenna: samantekt á vinsælum sjúkdómsvísindum og sönnunargögnum á rannsóknarstofu.Kato I., Zhang J. og Sun J. Bakteríu-veiru milliverkanir í krabbameini í meltingarvegi og krabbameini í kynfærum kvenna: samantekt á faraldsfræðilegum og rannsóknarstofugögnum.Krabbamein 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Frá sýkingu til krabbameins: Hvernig DNA æxlisvírusar breyta kolefnis- og fituefnaskiptum hýsilfrumna. Magon, KL & Parish, JL Frá sýkingu til krabbameins: Hvernig DNA æxlisvírusar breyta kolefnis- og fituefnaskiptum hýsilfrumna.Mahon, KL og Parish, JL. Eldsýking í krabbameini: hvernig DNA-undirstaða æxlisveira breyta kolefnis- og fituefnaskiptum hýsilfrumna. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代谢 Magon, KL & Parish, JL Frá sýkingu til krabbameins: hvernig DNA æxlisveirur breyta kolefnis- og fituefnaskiptum hýsilfrumna.Mahon, KL og Parish, JL Eldur sýkingu í krabbamein: hvernig DNA æxlisveirur breyta miðlægum kolefnis- og fituefnaskiptum í hýsilfrumum.Opin líffræði.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM o.fl.Catechol estrógen úr schistosomes og lifrarblanda og helminth-tengt krabbameini.framan.heitt að innan.5, 444 (2014).