Giardia skeifugörn er sníkjudýr sem veldur giardiasis, þarmasýkingu sem er sérstaklega algeng hjá ungum börnum með klínísk einkenni niðurgangs.Við höfum áður greint frá því að utanfrumu G. duodenalis kveiki á virkjun á innanfrumu oligomerization-like receptor 3 (NLRP3) bindandi núkleótíðum og stjórnar bólguviðbrögðum hýsils í gegnum seytingu utanfrumublöðru (EV).Hins vegar á eftir að útskýra nákvæmlega sameindamynstur sýklatengdra duodenococcal EV (GEV) sem taka þátt í þessu ferli og hlutverk NLRP3 bólgusíma í giardiasis.
Raðbrigð heilkjörnungatjáningarplasmíð pcDNA3.1(+)-alfa-2 og alfa-7.3 giardín í GEV voru smíðuð, færð inn í frumkviðhimnuátfrumur músa og greind með því að mæla bólgumarksameindina caspase-1.P20 tjáningarstigið var skimað..G. duodenalis alfa-2 og alfa-7.3 giardín voru upphaflega auðkennd með því að mæla NLRP3 inflammasome (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 og caspase-1 p20), IL seytingu.1β gildi, apoptotic spotted protein (ASC) fáliðunarstig og ónæmisflúrljómandi staðsetning NLRP3 og ASC.Hlutverk NLRP3 inflammasome í sjúkdómsvaldandi áhrifum G. duodenalis var síðan metið með því að nota mús þar sem NLRP3 virkjun var læst (NLRP3 stíflað mýs) og fylgst með meinafræðilegum breytingum á líkamsþyngd, skeifugarnarsníkjuálagi og skeifugarnarvef.Að auki könnuðum við hvort hiardín alfa-2 og alfa-7.3 framkalla IL-1β seytingu in vivo í gegnum NLRP3 inflammasome og ákváðum hlutverk þessara sameinda í sjúkdómsvaldandi áhrifum G. duodenalis í músum.
Alfa-2 og alfa-7.3 giardín örva virkjun NLRP3 inflammasomes in vitro.Þetta leiddi til virkjunar á p20 kaspasa-1, aukningu á tjáningarstigi NLRP3, pro-IL-1β og pro-kaspasa-1 próteina, marktækrar aukningar á seytingu IL-1β, myndun ASA bletta í umfrymi og örvun ASA fáliðunar.NLRP3 bólga Tap í getnaðarlim eykur sjúkdómsvaldandi áhrif G. duodenalis í músum.Mýs sem voru meðhöndlaðar með blöðrum með magaslöngu frá NLRP3-stífluðum músum sýndu aukinn fjölda trophozoites og alvarlega skemmdir á skeifugörnvilli, sem einkenndist af necrotic crypts með hoped and branching.In vivo tilraunir hafa sýnt að giardín alfa-2 og alfa-7.3 geta framkallað seytingu IL-1β í gegnum NLRP3 inflammasome og ónæmisaðgerð með giardínum alfa-2 og alfa-7.3 dró úr sjúkdómsvaldandi áhrifum G. duodenalis í músum.
Samanlagt benda niðurstöður þessarar rannsóknar til þess að giardia alfa-2 og alfa-7.3 valdi uppstjórnun á NLRP3 bólgu hýsils og dragi úr sýkingargetu G. duodenalis í músum, sem eru vænleg markmið til að koma í veg fyrir giardiasis.
Giardia skeifugörn er utanfrumu frumdýrasníkjudýr sem lifir í smáþörmum og veldur 280 milljónum tilfella af giardiasis með niðurgangi árlega, sérstaklega meðal ungra barna í þróunarlöndum [1].Fólk smitast af drykkjarvatni eða matvælum sem mengast af M. skeifugörnblöðrum sem fara síðan í magann og skiljast út í magasafa.Giardia skeifugörn trophozoites festast við skeifugarnarþekjuna og valda ógleði, uppköstum, niðurgangi, kviðverkjum og þyngdartapi.Einstaklingar með ónæmisbrest og slímseigjusjúkdóm eru viðkvæmir fyrir sýkingu.Sýking getur einnig átt sér stað með munn- og endaþarmsmök [2].Lyf eins og metrónídazól, tinídazól og nítazoxaníð eru ákjósanleg meðferðarúrræði við skeifugarnarsýkingum [3].Hins vegar valda þessi krabbameinslyfjalyf aukaverkanir eins og ógleði, krabbameinsvaldandi áhrif og eiturverkanir á erfðaefni [4].Þess vegna þarf að þróa árangursríkari aðferðir til að koma í veg fyrir G. duodenalis sýkingu.
Inflammasóm eru flokkur frumufrumuefnapróteinafléttna sem eru hluti af meðfæddu ónæmissvörun, hjálpa til við að verjast innrás sýkla og miðla bólgusvörun [5].Meðal þessara inflammasóma hefur núkleótíð-bindandi fáliðun (NOD) viðtaka 3 (NLRP3) núkleótíð-bindandi fáliðun (NLRP3) núkleótíð-bindandi eins inflammasóm verið rannsakað mikið vegna þess að það er hægt að greina með ýmsum sýkla/skemmdum tengdum sameindamynstri (PAMP/ DAMP), þekkir, virkjar meðfædda ónæmiskerfið.og stjórnar jafnvægi í þörmum í mörgum bólgusjúkdómum [6,7,8].Það samanstendur af mynsturþekkingarviðtaka (PRR) NLRP3, apoptotic spotted protein (ASC), og effector procaspase-1 eða procaspase-11.NLRP3 inflammasome virkar sem hýsil gegn innrás sýkla, eins og sést í Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] og Leishmania rannsóknum.[11], en einnig hefur verið greint frá því að virkjun NLRP3 inflammasomes takmarkar verndandi ónæmissvörun og eykur framvindu sjúkdóms, til dæmis í ormum [12].Byggt á fyrri niðurstöðum okkar greindum við frá því að utanfrumu G. duodenalis kveiki á innanfrumuvirkjun NLRP3 bólgu og mótar bólguviðbrögð hýsils með því að seyta utanfrumublöðrum (EVs) [13].Hins vegar á eftir að ákvarða hlutverk NLRP3 inflammasome í G. duodenalis sýkingu in vivo.
Giardínum var upphaflega lýst sem byggingarhlutum G. duodenalis frumubeinagrindarinnar og gegna mikilvægu hlutverki í hreyfanleika trophozoites og viðhengi þekjufrumna í smáþörmum.Til að laga sig betur að umhverfinu og auka sjúkdómsvaldandi eiginleika þeirra, þróuðu G. duodenalis trophozoites einstaka frumubeinagrind sem samanstóð af 8 flagellum, 1 miðkroppi og 1 kviðskífu [14].Trophozoites Giardia skeifugörnarinnar nota frumubeinagrind sína til að komast inn í efri smágirnina, sérstaklega skeifugörnina, og festast við innyfrumur.Þeir flytjast stöðugt og festast við þekjufrumur með umbrotum frumna.Þess vegna er náið samband á milli frumubeina þeirra og meinvirkni.Giardín sem eru sértæk fyrir Giardia skeifugörn eru hluti af frumubeinagrind uppbyggingu [15] og er skipt í fjóra flokka: α-, β-, γ- og δ-giardines.Það eru 21 meðlimir α-giardin fjölskyldunnar, sem allir hafa kalsíumháða getu til að binda fosfólípíð [16].Þeir tengja einnig frumubeinagrindina við frumuhimnuna.Hjá einstaklingum með niðurgang af völdum G. duodenalis eru α-giardín mjög tjáð og ónæmisvirk við sýkingu [17].Ólík bóluefni byggð á Giardia alfa-1 vernduð gegn giardiasis í músum og eru hugsanlegir mótefnavakar til að þróa bóluefni [18].Alfa-8 giardín, staðbundið í plasmahimnu og flagellum, en ekki í kviðskífunni, eykur hreyfanleika og vaxtarhraða trophozoites í G. duodenalis [19].Alpha-14 giardin festist við örpíplabyggingar á flagellum og hefur áhrif á lífvænleika G. duodenalis [20].Alfa-11 giardín er til staðar í gnægð allan lífsferilinn og oftjáning alfa-11 giardíns skaðar sjálfan G. duodenalis [21].Hins vegar er óljóst hvort alfa-2 giardín og alfa-7.3 giardín séu verndandi gegn G. duodenalis sýkingu og undirliggjandi aðferðum þeirra.
Í þessari rannsókn voru raðbrigða heilkjörnungatjáningarplasmíð pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardín og pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardín umbreytt í frumkviðhimnuátfrumur músa til að virkja NLRP3 hýsil.Síðan voru bólgueyðandi skotmörk skimuð.Við metum einnig hlutverk NLRP3 inflammasomes í sjúkdómsvaldandi áhrifum G. duodenalis, könnuðum hvort alfa-2 og alfa-7,3 giardín valdi virkjun NLRP3 inflammasómsins in vivo og komumst að því að þessi tvö hlutverk giardína í sjúkdómsvaldandi áhrifum G. skeifugörn.Sameiginlegt markmið okkar var að þróa efnileg markmið til að koma í veg fyrir G. duodenalis sýkingu.
Villigerð (WT) C57BL/6 kvenkyns mýs á aldrinum 5-8 vikna voru keyptar frá Liaoning Changsheng Experimental Animal Center (Liaoning, Kína).Mýs höfðu frjálsan aðgang að vatni, fengu sótthreinsaða mat og var haldið í 12/12 klst ljós/myrkri hringrás.Fyrir sýkingu fengu mýs sýklalyf að vild í drykkjarvatni ásamt ampicillíni (1 mg/ml), vancomycin (1 mg/ml) og neomycin (1,4 mg/ml) (allt keypt frá Shanghai, Kína, gervilífverur) [22 ].].Mýs sem misstu getu til að borða og drekka í > 24 klukkustundir og misstu ≥ 20% líkamsþyngd voru aflífaðar á mannúðlegan hátt með leghálsi.
WB G. duodenalis trophozoites (American Type Culture Collection, Manassas, Bandaríkjunum) var bætt við 12,5% nautgripasermi (FBS; Every Green, Zhejiang, Kína) og 0,1% nautgripagalli (Sigma-Aldrich, St. Missouri, Bandaríkjunum) ).USA) við örloftháðar aðstæður.Samflotnum trophozoites var safnað á ís og farið í gegnum í hlutfallinu 1:4 til frekari æxlunar.
Giardia skeifugörn blöðrur voru framkallaðar eins og áður hefur verið lýst [23], trophozoites voru safnað í logaritmískum fasa og síðan þynnt með hjúpunarörvandi miðli, pH 7,1 (breytt TYI-S-33) í lokastyrk upp á 1 × 106 trophozoites/ml.styrkur galls 0,05% miðlungs).Trophozoites voru ræktuð við loftfirrðar aðstæður við 37°C fram að logaritmískum vaxtarfasa.Skiptu um miðil í blöðruframkallandi miðil (pH 7,8; ​​breytt TYI-S-33 miðli með 1% gallstyrk) og ræktaðu G. duodenalis við 37°C í 48–96 klukkustundir, þar sem blöðrurnar mynduðust í smásjá.Eftir að flestir trophozoites höfðu verið framkallaðir til að mynda blöðrur, var ræktunarblandan uppskorin og endurleyst í dauðhreinsuðu afjónuðu vatni til að rjúfa trophozoites sem eftir voru.Blöðrur voru taldar og geymdar við 4°C fyrir síðari greiningar í gegnum magaslöngu í músum.
Giardia utanfrumublöðrur (GEVs) voru auðgaðar eins og áður hefur verið lýst [13].Trophozoites í logaritmískum vaxtarfasa voru endurblandaðir í breyttum TYI-S-33 miðli sem útbúinn var með exosome-þurrt FBS (Biological Industries, Beit-Haemek, Ísrael) í lokastyrk upp á 1 × 106 sníkjudýr/ml og ræktuð í 12 klukkustundir.voru einangruð úr ræktunarfljótandi vökvanum með skilvindu við 2000 g í 10 mínútur, 10.000 g í 45 mínútur og 100.000 g í 60 mínútur.Botnfallið var leyst upp í fosfatbuðrað saltvatni (PBS), magnmælt með BCA próteinprófunarsetti (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) og geymt við -80°C eða notað beint til frekari greiningar.
Fyrstu kviðfrumur músa voru útbúnir eins og áður hefur verið lýst [24].Í stuttu máli var músum (6-8 vikna á aldrinum) sprautað (í kviðarhol [ip]) með 2,5 ml af 2,98% Difco fljótandi þíóglýkóli (BD, Franklin Lakes, NJ, Bandaríkjunum) og þeim gefið 3-4 góma.Sviflausn af átfrumum var safnað úr kviðarholi músa eftir líknardráp og skilið í skilvindu þrisvar sinnum við 1000 g í 10 mínútur.Uppskerufrumur voru greindar með frumuflæðisgreiningu með því að nota CD11b merkið þar til frumuhreinleiki var >98%, þeim var síðan bætt við 6-brunn frumuræktunarplötur (4,5 x 106 frumur/brunn) og ræktaðar með 10% FBS (Lífiðnaður) við 37°C.og 5% CO2.
RNA var dregið úr 1 × 107 trophozoites í 1 ml af TRIzol hvarfefni (Vazyme, Nanjing, Kína), erfðafræðilegt DNA var dregið úr heildar G. duodenalis RNA með MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, Kína) og viðbótar-DNA (cDNA) var búið til með því að nota MonScript RTIIII Super Mix (Monad) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.
Upplýsingar um CDS röð fyrir G. duodenalis markgenið voru fengnar frá NCBI GenBank.Notaðu Primer 5.0 til að hanna sérstaka óaðfinnanlega klónunarprimera fyrir hvert markgen.Framvirki grunnurinn (5′-3′) samanstendur af þremur hlutum: röð sem skarast með línugerðri vektor pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) og upphafskódon ATG og GNN (ef fyrsti basinn er ekki G).Þetta er gert til að bæta skilvirkni tjáningarinnar.Að auki að minnsta kosti 16 bp samsettir basar (GC innihald 40–60%/Tm u.þ.b. 55 °C).Andstæða grunnurinn (5′-3′) samanstendur af tveimur hlutum, röð sem skarast með EcoRV-línugreindri vektor pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) og samsettan basa sem er að minnsta kosti 16 bp.(að undanskildum tveimur síðustu stoppunum).basa) kódon eins og AA eða GA til að leyfa raðbrigðum plasmíðum að tjá merkt prótein þeirra).Grunnraðirnar eru skráðar í töflu 1 og voru framleiddar af Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, Kína).
Markmið voru mögnuð með því að nota Pfu DNA pólýmerasa (Tiangen, Peking, Kína) eða Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Peking, Kína) með því að nota tilbúið G. duodenalis cDNA sem sniðmát.Heilkjörnunga tjáningarferjuplasmíð pcDNA3.1(+) var línuskipt með skerðingarensími EcoRV og affosfórýleruð með Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Línuleg pcDNA3.1(+) brot og mögnuð markgenbrot voru hreinsuð með DNA hlauphreinsunarbúnaði (Tiangen) og magngreind með Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).pcDNA3.1(+) brotið og hvert markgenbrot voru sameinuð aftur með því að nota MonClone einræktunarblöndu (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, Kína) og staðfest með DNA raðgreiningu með Comate Bioscience Company Limited (Changchun, Kína)..
Endotoxínlaus plasmíð pcDNA3.1(+)-alfa-2 og pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 voru mynduð með SanPrep Endotoxin-frítt Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech).Styrknum var haldið yfir 500 ng/µl til að tryggja að EDTA í skolunarjafnalausninni truflaði ekki flutningsgreininguna.Primary peritoneal macrophagar músa voru ræktaðir í 6-brunnu plötum með fullkomnu RPMI 1640 miðli (Biological Industries) í 12 klukkustundir, síðan voru frumurnar þvegnar þrisvar sinnum í heitu PBS til að fjarlægja penicillín og streptómýsín, og síðan í miðli sem bætt var við heilum miðli.Endotoxínlaus plasmíð pcDNA3.1(+)-alfa-2 og pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (2,5 μg) voru þynnt í 125 μl af Opti-MEM skertu sermimiðli (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Síðan var 5 µl af Lipofectamine 2000 transfection hvarfefni (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) þynnt í 125 µl af lágsermi Opti-MEM miðli.Undirbúið lípósóm-DNA fléttur með því að blanda þynntu endótoxínfría plasmíðinu við Lipofectamine 2000 og leyfa blöndunni að standa við stofuhita í 5 mínútur.Flyttu flétturnar sérstaklega yfir í frumur í hverjum brunni og blandaðu hægt.Eftir 4 klukkustundir var frumuræktunarætinu skipt út fyrir 2 ml af fullkomnu RPMI 1640 miðli og ræktun var haldið áfram í 24 klukkustundir.Fersku frumuræktunarmiðli var bætt við frumurnar og ræktað í ýmsa tíma eftir hönnun prófunar.
Próteinsýni úr floti og frumulýsum voru útbúin eins og áður hefur verið lýst [25].Himnuflutningsbreytur fyrir pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-actin og His-tag voru 200 mA/90 mín.Fyrir interleukin 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, Bandaríkjunum), caspase-1 (p20) (Adipogen, Sviss) og NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Sviss) og 1:5000 sem miðar á His tag ( Amylet Scientific, Wuhan, Kína) og β-aktín (Proteintech, Wuhan, Kína).
Krosstenging við disuccinimide suberate (DSS) var framkvæmd eins og áður hefur verið lýst [26].Frumur voru þvegnar þrisvar sinnum með köldu PBS og fullkomlega ljósaðar með 27 gauge nál í 50 µl ASC hvarfjafna (pH 8,0) sem innihélt 25 mM Na2PO4, 187,5 mM NaCl, 25 mM HEPES og 125 mM NaHCO3.Blandan var skilin í skilvindu við 5000 g í 3 mínútur og pillan var saumuð með 10 µl DSS (25 mM í DMSO) og 40 µl ASC hvarfjafnalausn í 30 mínútur við 37°C.Eftir skilvindu við 5000 g í 10 mínútur var kögglan leyst upp í lausn af 40 µl af ASC hvarfstuðpúða og 10 µl af 6x próteinhleðslujafnalausn (TransGen, Peking, Kína), og síðan var lausnin slökkt við stofuhita í 15 mín., Sjóðið síðan í 10 mínútur.Próteinsýni voru síðan sett í Western blotting með því að nota aðal and-ASC mótefni (Wanleibio, Shenyang, Kína) í þynningarhlutfallinu 1:500.
Eftir áður lýst aðferð [13] var frumuræktarfrumvökvi safnað og seyting bólgueyðandi frumuvakans IL-1β var ákvarðað með því að nota mús IL-1 Beta ELISA settið (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Umbreyttu OD450nm gildum í próteinstyrk með því að nota IL-1β staðalferilinn.
Frumur húðaðar á hyljara voru þvegnar varlega þrisvar sinnum í heitu PBS, festar í vefjafrumufestiefni (Biosharp, Peking, Kína) í 10 mínútur við stofuhita (RT), í 0,1% Triton X-Permeabilize við 100 (þynnt í PBS; Biosharp ) í 20 mínútur við stofuhita og lokað í 5% nautgripasermi albúmín (í PBS) í 2 klukkustundir við stofuhita.Frumurnar voru síðan ræktaðar yfir nótt við 4°C með aðal mótefnum gegn ASC (1:100 þynning) eða NLRP3 (1:100 þynning), í sömu röð, og Cy3 merkt geit gegn kanínu IgG(H+L) (1:400; EarthOx) , San Francisco, CA, Bandaríkjunum) eða FITC-tengd geit-and-mús IgG (1:400; Earthox) yfir nótt við 37°C í myrkri í 1 klukkustund.Kjarnar voru litaðir með Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, Kína) í 5 mínútur og skoðaðir undir flúrljómunarsmásjá (Olympus Corporation, Tokyo, Japan).
Músum var skipt í fjóra hópa (n = 7 í hverjum hópi): (i) PBS-meðhöndlaður neikvæður samanburðarhópur (aðeins PBS; gjöf 100 µl/mús PBS fylgt eftir með daglegri inndælingu í kviðarhol 100 µl/mús PBS 3 klukkustundum síðar)., samfellt í 7 daga);(ii) neikvæður samanburðarhópur sem var meðhöndlaður með MCC950 hemli [27] (100 µl/mús með PBS gjöf, 3 klukkustundum síðar, 10 mg/kg líkamsþyngdar [BW] MCC950 [í PBS] var gefið í kviðarhol daglega, lengd 7 dagar);(iii) G. duodenalis blöðrusýkingarhópur (1,5 x 106 blöðrur/mús með magaslöngu, 3 klukkustundum síðar, 100 μl/mús PBS gefið í kviðarhol daglega í 7 daga);(iv) G. duodenalis blöðru samsettur sýkingarhópur MCC950 hemla meðferðarhópur (1,5×106 blöðrur/mús í gegnum magaslöngu, 10mg/kg líkamsþyngdar MCC950 í kviðarhol daglega í 7 daga eftir 3 klst.).Fylgst var með líkamsþyngd hverrar músar daglega og allar mýsnar voru aflífaðar á 7. degi.Uppskeran skeifugarnar (3 cm langur) var skorinn í litla bita í 1 ml PBS, blöðrur voru eytt yfir nótt í PBS við 4°C og G. duodenalis trophozoites.Nýr skeifugörn (1 cm langur) var einangraður fyrir hematoxylin og eosin (H&E) litun.
Músum var skipt í tvo hópa: (i) MOCK samanburðarhóp og (ii) MCC950 hemla hóp.Það voru fimm meðferðir í hverjum hópi (n = 7/meðferðarhópur): (i) PBS meðferð neikvæð viðmiðunarhópur (aðeins PBS; 100 µl/mús PBS, í vöðva (IM) inndæling (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) plasmíð neikvæður samanburðarhópur (100 µg/mús DNA, með inndælingu í vöðva) (iii) G. duodenalis blöðrusýkingar jákvæður samanburðarhópur (1,5 x 106 blöðrur/mús, með magagjöf) (iv) a); hópur meðhöndlaður með plasmíði pcDNA3.1(+)-alfa-2 (100 μg/mús DNA, með inndælingu í vöðva), og (v) hópur meðhöndlaður með plasmíði pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (100 µg/mús) DNA, eftir 12 klukkustunda leið, fengu mýs í MCC950 hemla hópnum daglega inndælingu í kviðarhol af MCC950 (10 mg/kg líkamsþyngdar) í 7 daga, en mýs í MOCK hópnum fengu jafnt magn af PBS meðferð. Blóðsýni voru safnað úr augnboltamúsunum og skilin eftir yfir nótt við 4 °C Sermissýni voru einangruð með því að nota ensímtengd ónæmissogandi prófun (ELISA) fyrir og mælingar á IL-1β gildum.
Þrjátíu og fimm músum var skipt í fimm hópa (n=7/hóp).Hópur 1 var neikvæður samanburðarhópur sem var meðhöndlaður með PBS: mýs fengu 100 μl af PBS í vöðva og 3 dögum síðar með magaslöngu.Hópur 2 er jákvæður samanburðarhópur sýktur af G. duodenalis blöðrum: músum var sprautað með 100 μl af PBS og 3 dögum síðar var 1,5 x 106 blöðrur/mús sprautað í maga.Þriðji hópur – plasmíð ónæmisaðgerð með pcDNA3.1(+) ásamt viðmiðunarhópi fyrir skeifugörnblöðrusýkingu: mýs fengu 100 μg af plasmíði DNA pcDNA3.1(+)(im) til inntöku, 1,5×106 blöðrur/mús 3 fyrir nokkrar daga.Hópar 4 og 5 voru raðbrigða pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardín plasmíð eða pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardín plasmíð ásamt G. duodenalis blöðrusýkingu.Tilraunahópur: mýs fengu 100 µg af pcDNA3.1(+)-giardín plasmíði DNA (im), síðan 3 dögum síðar var 1,5 × 106 blöðrur/mús sprautað með magaslöngu.Fylgst var með líkamsþyngd hverrar músar eftir að G. duodenalis blöðrunni var komið í gegnum slönguna.Ferskum skeifugörn var safnað fyrir mælingar á sníkjudýrum og HE-litunargreiningu.
Vefjameinafræðilegar breytingar voru greindar samkvæmt áður birtri aðferð [30].Ferskur skeifugörn var festur með veffrumufestiefni, felld inn í paraffín, skorinn í 4 μm hluta, litaður með H&E og greindur í ljóssmásjá.Merkilegar meinafræðilegar breytingar í sjö vefjahlutum frá sjö sjálfstæðum músum voru metnar af meinafræðingi sem ekki vissi um meðferðina og voru fangaðar með 200x stækkun.Lengd villisins og dýpt huldanna voru mæld í samræmi við áður lýstar aðferðir.
Niðurstöðurnar in vitro og in vivo fengust í þríriti.Línurit voru búin til með því að nota GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, Bandaríkjunum).Munur á milli tveggja hópa var greindur með t-prófi, en munur á milli ≥3 hópa var greindur með einhliða dreifigreiningu (ANOVA) með SPSS hugbúnaði (útgáfa 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA).Gögn voru greind með tilliti til einsleitni dreifni með Levene's prófi og síðan Bonferroni's post hoc prófi (B).Marktekt er gefin upp sem P<0,05, P<0,01 og P<0,001 (ekki marktækt [ns]) (P>0,05).
Fyrri greining okkar á GEV próteinfræði í Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) sýndi að mörg markmið gætu tekið þátt í virkjun bólguboðaleiða [13].Við völdum tvö efnileg markmið, alfa-2 og alfa-7.3 giardín, mögnuðum þessar sameindir og notum þær til að smíða pcDNA3.1(+) heilkjörnungatjáningarferjuna.Eftir raðgreiningu voru raðbrigða pcDNA3.1(+)-alfa-2 og alfa-7.3 giardín tjáningarplasmíð færð yfir í aðal kviðfrumuátfrumur músa og caspase-1 p20 einkenni bólguprótein (brot af virkjaðri caspasa-1) var auðkennt. sem skýra lykilsameindir sem geta kallað fram bólgu.Niðurstöðurnar sýndu að alfa-2 og alfa-7.3 giardín geta framkallað p20 kaspasa-1 tjáningu svipað og GEV.Engin áhrif á virkjun kaspasa-1 fundust í ómeðhöndluðu neikvæðu viðmiðinu (aðeins PBS) og plasmíðviðmiðun pcDNA3.1(+) (mynd 1).
Mæling á p20 kaspasa-1 virkjun með pcDNA3.1(+)-alfa-2 og alfa-7.3 giardínum.Raðbrigða heilkjörnungatjáningarplasmíð pcDNA3.1(+)-alfa-2 og alfa-7.3 giardín (fyrir ofan hverja braut) voru umbreytt inn í aðal kviðfrumuátfrumur músa og ræktunarfrumvökvi var safnað 24 klukkustundum síðar.Western blotting var notað til að mæla tjáningarstig einkennis caspase-1 p20 inflammasome próteins.PBS-eingöngu meðferðarhópurinn (braut C) og pcDNA3.1(+) einlyfjameðferðarhópurinn (pcDNA3.1 braut) voru notaðir sem neikvæður samanburður og GEV meðferðarhópurinn var notaður sem jákvæður samanburður.Tjáning raðbrigða próteinsins var staðfest með því að greina histidínmerki í hverju próteini og væntanleg próteinbönd voru alfa-2 giardín (38,2 kDa) og alfa-7,3 giardín (37,2 kDa).GEV, Giardia skeifugörn utanfrumublöðrur, pcDNA3.1(+), EcoRV-línulögð vektor, SUP, flot
Til að ákvarða hvort alfa-2 giardín og alfa-7.3 giardín örva p20 caspase-1 tjáningu og gegna hlutverki við að virkja NLRP3 bólgusvörun hýsilsins, pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardín og pcDNA3.1(+)-alfa -7,3 giardín var umbreytt inn í frumkviðhimnuátfrumur músa með raðbrigða plasmíði DNA, og magn tjáningar, staðsetningar og fáliðunar á bólgueyðandi próteinum NLRP3 var ákvarðað.Í þessari tilraun var GEV notað sem jákvæði viðmiðunarhópurinn og hópurinn sem var ekki meðhöndlaður (aðeins PBS) eða pcDNA3.1(+) transfection meðferðarhópurinn var neikvæði hópurinn.Niðurstöðurnar sýndu að, eins og í GEV hópnum, leiddi raðbrigða plasmíð DNA af giardin pcDNA3.1(+)-alfa-2 og giardin pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 til uppstjórnunar NLRP3, pro-IL-1β og procaspase-1 og caspase-1 virkjun (Mynd 2a).Að auki ollu bæði giardín marktæka IL-1β seytingu (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,1000; alfa-2 giardín: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0007 ).;alfa-7,3 giardín: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (Mynd 2b).Flest ASC prótein voru einliða í hópnum sem ekki var meðhöndluð eða í meðferðarhópnum sem var sýkt með pcDNA3.1(+) plasmíði, öfugt við pcDNA3.1(+)-alfa-2 eða pcDNA3.1(+)-alfa- 7,3 giardine.ASC fáliðun átti sér stað í raðbrigða plasmíð DNA í GEV jákvæða samanburðarhópnum eða hópnum, sem sýndi fáliðaform (Mynd 2c).Þessar bráðabirgðatölur benda til þess að alfa-2 giardín og alfa-7,3 giardín geti framkallað NLRP3 bólguvirkjun.Síðari ónæmisflúrljómandi rannsóknir á staðsetningu ASC og NLRP3 sýndu að í neikvæða samanburðarhópnum var ASC próteinið dreift um umfrymið og birtist sem punktamerki við örvun á pcDNA3.1(+)-alfa-2 með giardíni eða pcDNA3.1(+)-alfa-7,3 giardín hópur eða GEV jákvæður samanburðarhópur (Mynd 2d).Í neikvæðu viðmiðunarhópnum og plasmíðmeðhöndluðu pcDNA 3.1 hópunum greindist NLRP3 próteinmerki ekki, en flúrljómandi merkispunktur sem svar við pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardíni eða pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 greindist..giardín finnast í umfrymi eða við örvun HEV (Mynd 2e).Þessar upplýsingar sýna ennfremur fram á að G. duodenalis giardin alfa-2 og giardin alfa-7.3 virkja NLRP3 bólgusíma í frumkviðhimnuátfrumum músa.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin og pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin virkja NLRP3 inflammasome í kviðfrumum músa.Fluttu raðbrigðu heilkjörnungatjáningarplasmíðin pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin og pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin í frumu kviðhimnuátfrumur og frumur músa, eða uppskerið flotið innan 24 klst. til greiningar á tjáningu, fáliðun. , seyting.og staðsetning lykilbólgupróteina.PBS-einungis (C) hópurinn og pcDNA3.1(+) einn meðferðarhópurinn voru notaðir sem neikvæða viðmiðunarhópurinn og GEV meðferðarhópurinn var notaður sem jákvæði hópurinn.a Lykilbólguprótein NLRP3, þar á meðal NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1 og p20 caspase-1, greindust með Western blotting.b Seytingarmagn IL-1β í flotinu var ákvarðað með því að nota ensímtengd ónæmissogandi prófun (ELISA).Munur á samanburðarhópum og tilraunahópum var greindur með einhliða dreifigreiningu (ANOVA) með SPSS hugbúnaðarútgáfu 22.0.Stjörnumerki gefa til kynna marktækan mun á milli hópa **P<0,01 og ***P<0,001.c ASC fáliðunarstig í kögglum var ákvarðað með DSS krosstengingargreiningu, en ASC gildi í frumulýsum voru notuð sem hleðsluviðmiðun.d Sjónræn staðsetning ISC með ónæmisflúrljómun.e Ónæmisflúrljómun var notuð til að sjá staðsetning NLRP3.ASC, apoptotic flekklíkt prótein;IL, interleukin;NLRP3, núkleótíðbindandi fáliðunarlíkur viðtaki 3;ns, ekki marktækt (P > 0,05)
Bæði G. duodenalis og GEVs sem það seytir virkja NLRP3 bólgusvörun og stjórna bólguviðbrögðum hýsilsins in vitro.Þannig er hlutverk NLRP3 inflammasome í sjúkdómsvaldandi áhrifum G. duodenalis enn óljóst.Til að kanna þetta mál, hönnuðum við tilraun á milli músa sem sýktar voru af G. duodenalis blöðru og músum sem voru sýktar af G. duodenalis blöðru + MCC950 hemli meðferð og borin saman NLRP3 bólgueyðandi tjáningu þegar þeir voru sýktir af G. duodenalis blöðru.Nákvæmt skipulag tilraunarinnar er sýnt á mynd 3a.Fylgst var með breytingum á líkamsþyngd músa í mismunandi meðferðarhópum í 7 daga eftir sýkingu með blöðrum og eru niðurstöðurnar sýndar á mynd 3b.Í samanburði við hópinn sem var meðhöndlaður með hreinu PBS sýndu niðurstöðurnar að (i) líkamsþyngd músa sem voru sýktar af G. duodenalis blöðru minnkaði frá degi 3 til dag 7 eftir sýkingu;(ii) meðferð með MCC950 hemlinum hafði engin marktæk áhrif á líkamsþyngd músanna..Í samanburði við einstaka sýkingarhópinn minnkaði BW í skeifugarnarsýkingarhópnum sem var meðhöndluð með MCC950 í mismiklum mæli (Dagur 1: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; Dagur 2: ANOVA, F( 3, 24) ) = 0,4602, P<0,0001; Dagur 3: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010; (3, 24)=0,6497, P=0,0645; Dagur 6: ANOVA, F(3, 24)=5,457, P=0,0175; Dagur 7: ANOVA, F(3, 24) = 2,893, P=0,0202).Þessar upplýsingar sýna að NLRP3 inflammasome verndar mýs gegn verulegu þyngdartapi á fyrstu stigum (2-4 dagar) skeifugarnarsýkingar.Síðan var stefnt að því að greina G. duodenalis trophozoites í skeifugarnarskolunarvökva og eru niðurstöðurnar sýndar á mynd 3c.Í samanburði við G. duodenalis blöðrusýkingarhópinn jókst fjöldi trophozoites í skeifugörninni marktækt eftir að hafa blokkað NLRP3 inflammasome (t(12) = 2,902, P = 0,0133).Skeifugarnarvefir litaðir með HE sýndu, samanborið við neikvæða samanburð sem var meðhöndluð með PBS og MCC950 eingöngu: (i) G. duodenalis blöðrusýking leiddi til skemmda á skeifugarnarvilli (ANOVA, F(3, 24)=0,4903, P= 0,0488 ) og dulmálsrýrnun (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) skeifugörn úr músum sem sýktar eru af G. duodenalis blöðrum og meðhöndlaðar með MCC950 hemlum.skeifugarnarvilli voru skemmdir og dauðir (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) með rýrnun og dulmálsgrein (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (Mynd 3d- f) .Þessar niðurstöður benda til þess að NLRP3 inflammasome gegni hlutverki við að draga úr sjúkdómsvaldandi áhrifum G. duodenalis.
Hlutverk NLRP3 inflammasome í Giardia skeifugörn sýkingu.Mýs voru teknar í magagjöf (iv) með skeifugörnakokkblöðrum og síðan meðhöndlaðar með eða án MCC950 (ip).Einstakir meðferðarhópar með PBS eða MCC950 voru notaðir sem viðmið.Tilraunahópur og meðferðaráætlun.b Fylgst var með líkamsþyngd músa í hverjum hinna ýmsu meðferðarhópa í 7 daga.Munurinn á G. duodenalis sýkingarhópnum og G. duodenalis + MCC950 sýkingarmeðferðarhópnum var greindur með t-prófi með SPSS hugbúnaðarútgáfu 22.0.Stjörnumerki gefa til kynna marktækan mun við *P<0,05, **P<0,01 eða ***P<0,001.c Sníkjudýraálag var ákvarðað með því að telja fjölda trophozoites í skeifugarnarskolunarvökva.Munurinn á G. duodenalis sýkingarhópnum og G. duodenalis + MCC950 sýkingarmeðferðarhópnum var greindur með t-prófi með SPSS hugbúnaðarútgáfu 22.0.Stjörnumerki gefa til kynna marktækan mun við *P < 0,05.d Niðurstöður hematoxýlíns og eósíns (H&E) litunar vegna vefjameinafræði í skeifugarnar.Rauðar örvar gefa til kynna skemmdir á villi, grænar örvar benda til skemmda á crypts.Mælikvarðarstöng: 100 µm.e, f Tölfræðileg greining á hæð skeifugörnvillus og hæð músarkrabba.Stjörnumerki gefa til kynna marktækan mun við *P<0,05 og **P<0,01.Niðurstöðurnar eru teknar úr 7 óháðum líffræðilegum tilraunum.BW, líkamsþyngd;ig, fæðingarleið í maga;ip, fæðingarleið í kviðarhol;ns, ekki marktækt (P > 0,05);PBS, fosfatjafnað saltvatn;WT, villigerð
Seyting IL-1β er einkenni bólguvirkjunar.Til að ákvarða hvort G. duodenalis alfa-2 giardín og alfa-7.3 giardín virkja NLRP3 hýsilbólga in vivo, notuðum við ómeðhöndlaðar WT mýs (sham hópur) og NLRP3 inflammasome-blokkaðar mýs (MCC950 hindrað meðferðarhóp).Nákvæmt skipulag tilraunarinnar er sýnt á mynd 4a.Tilraunahópar samanstóð af músum sem fengu PBS, G. duodenalis blöðrumeðferð með magaslöngu, inndælingu í vöðva með pcDNA3.1 og inndælingu í vöðva með pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardíni eða pcDNA3.1-alfa-7.3 giardíni.Á 7. degi eftir gjöf raðbrigða plasmíðsins í vöðva var sermi safnað og magn IL-1β í hverjum hópi ákvarðað.Eins og sést á mynd 4b, í MOCK hópnum: (i) samanborið við PBS hópinn hafði pcDNA3.1 meðferð engin marktæk áhrif á IL-1β seytingu (ANOVA, F(4,29)=4,062, P=0,9998), hins vegar, IL-β seyting var marktækt hækkuð í G. duodenalis blöðruhópnum (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) pcDNA3.1-alfa-2 giardín og pcDNA3.1- Inndæling alfa-7.3 giardíns í vöðva jók marktækt sermisþéttni IL-1β (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P<0.0001);(iii) pcDNA3.1-alfa-7,3 giardín framkallaði mikið magn af IL -1β seytingu í hópnum sem sprautað er í pcDNA3.1-alfa-2 giardín í vöðva (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0333) .Samanborið við hvern hóp í MCC950 meðferðarhópnum og MOCK hópnum: (i) IL-1β seytingarmagn í PBS samanburðarhópnum og pcDNA3.1 samanburðarhópnum minnkaði að vissu marki eftir að hafa hindrað MCC950 hemilinn, en munurinn var ekki marktækt (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) eftir að hafa lokað á MCC950., IL-1β seyting minnkaði marktækt í G. duodenalis blöðrusýkta hópnum, pcDNA3.1-alfa-2 giardine hópnum og pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine hópnum (G. duodenalis: ANOVA, F(9) , 58) = 3,540, P = 0,0120; ) = 3,540, P = 0,0164).Þessar niðurstöður benda til þess að alfa-2 giardín og alfa-7.3 giardín miðli virkjun NLRP3 inflammasomes in vivo.
pcDNA3.1(+)-giardín virkja NLRP3 hýsilbólga in vivo.Mýs voru bólusettar (IM) með raðbrigða heilkjörnungatjáningarplasmíði pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardíni eða pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardíni og síðan meðhöndlaðar með MCC950 (ip; MCC950 hópur) eða ekki (gallahópur) ).PBS eða pcDNA3.1(+) plasmíð meðferðarhópurinn var notaður sem neikvæður samanburður, G. duodenalis blöðrumeðferðarhópurinn var notaður sem jákvæður samanburður.Tilraunahópur og meðferðaráætlun.b Sermisþéttni IL-1β í músum var mæld á 7. degi með ELISA prófi.Munur á hópum í MOCK hópnum var greindur með einstefnu ANOVA og munur á MOCK hópnum og MCC950 hópnum var greindur með t-prófi SPSS hugbúnaðarútgáfu 22.0.Stjörnumerki gefa til kynna marktækan mun á meðferðarhópum í MOCK hópnum, *P<0,05 og ***P<0,001;dollaramerki ($) gefa til kynna marktækan mun á hverjum hópi í MOCK hópnum og MCC950 hópnum við P<0,05.Niðurstöður sjö óháðra líffræðilegra tilrauna.i, inndæling í vöðva, ns, ekki marktæk (P > 0,05)
Til að kanna áhrif alfa-2 og alfa-7.3 giardínmiðlaðrar virkjunar á NLRP3 hýsilbólgubólgu á G. duodenalis sýkingu, notuðum við WT C57BL/6 mýs og sprautuðum alfa-2 giardíni og alfa-7.3 giardíni.plasmíðinu var sprautað í vöðva, eftir 3 daga í gegnum magaslöngu G. duodenalis blöðrunnar, eftir það var fylgst með músunum í 7 daga.Nákvæmt skipulag tilraunarinnar er sýnt á mynd 5a.Líkamsþyngd hverrar músar var mæld á hverjum degi, sýnum af ferskum skeifugarnarvef var safnað á 7. degi eftir gjöf í gegnum magaslöngu, fjöldi trophozoites mældur og vefjameinafræðilegar breytingar sáust.Eins og sýnt er á mynd 5b, með auknum fóðrunartíma, jókst BW músa í hverjum hópi smám saman.MT í músum fór að minnka á 3. degi eftir gjöf G. duodenalis blöðrur í maga og jókst síðan smám saman.Virkjun NLRP3 inflammasome framkallað með inndælingu alfa-2 giardíns og alfa7.3 giardíns í vöðva dró verulega úr þyngdartapi hjá músum (dagur 1: pcDNA3.1-alfa-2 giardín, ANOVA, F(4, 30) = 1.399, P = 0 ,9754 Dagur 1: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardín, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 Dagur 2: pcDNA3.1-alfa-2 giardín, ANOVA, F( 4, 30) = 0,3172, P = 0,9979; Dagur 2: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardín, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.8409; Dagur 3: pcDNA3.1-alfa-2 giardín, ANOVA 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 Dagur 3: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardín, ANOVA, F(4, 30) = 0,8222, P = 0,0083 Dagur 4: pcDNA3.1-alfa-2 giardín , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, Dagur 4: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardín, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P < 0,0001, Dagur 5: pcDNA3.1-alfa - 2 giardín, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Dagur 5: pcDNA3.1-alfa -7.3 giardín, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Dagur 6: pcDNA3. alfa-2 giardín, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, Dagur 6: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardín, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;Dagur 7: pcDNA3.1-alfa-2 giardín, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P<0,0001 Dagur 7: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardín, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P <0,0001).Sníkjuálag var metið í skeifugörn (mynd 5c).Í samanburði við ómeðhöndlaða jákvæða samanburðinn og hópinn sem sprautaður var með tómu pcDNA3.1 ferjunni, var fjöldi G. duodenalis trophozoites verulega minnkaður í hópunum sem voru sprautaðir með α-2 giardíni og α-7,3 giardíni (pcDNA3.1-alfa) -2 giardín: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3,1-alfa-7,3 giardín: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P<0,0001).Að auki var giardine alfa-7,3 verndandi í músum en giardín alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0081).Niðurstöður HE-litunar eru sýndar á mynd.5d–f.Mýs sem sprautaðar voru með alfa-2 giardíni og alfa-7.3 giardíni höfðu færri skeifugarnarvefsskemmdir, sem komu fram með villusskemmdum, samanborið við mýs sem sprautaðar voru með G. duodenalis og mýs sem sprautaðar voru með G. duodenalis ásamt tómum pcDNA3 vektor .1 Zoom.(pcDNA3.1-alfa-2 giardín: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 eða P = 0.0068; pcDNA3.1-alfa-7.3 giardín: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0,0028 eða P = 0,0055) og minnkað rýrnun dulmáls (pcDNA3.1-alfa-2 giardín: ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 eða P = 0.0158; pcDNA3.1-alfa-7.3 giardín: ANOVA giardín , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 eða P = 0,0191).Þessar niðurstöður benda til þess að alfa-2 giardín og alfa-7,3 giardín dragi úr sýkingargetu G. duodenalis með því að virkja NLRP3 inflammasome in vivo.
Hlutverk pcDNA3.1(+)-giardins í G. duodenalis sýkingu.Mýs voru bólusettar (IM) með raðbrigðum heilkjörnungatjáningarplasmíðum pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardíni eða pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardíni og síðan ögraðar með G. duodenalis blöðrum (ig).PBS hópurinn og pcDNA3.1(+) + meðferðarhópur fyrir skeifugörn blöðru voru notaðir sem neikvæðir samanburðarhópar og skeifugörn blöðru meðferðarhópur var notaður sem jákvæður samanburðarhópur.Tilraunahópur og meðferðaráætlun.b Fylgst var með MT músum í hverjum hinna ýmsu meðferðarhópa í 7 daga eftir áskorun.Stjörnumerki gefa til kynna marktækan mun á hópum í G. duodenalis hópnum og pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardín hópnum, *P < 0,05, **P < 0,01 og ***P < 0,001;dollaramerkið ($) gefur til kynna marktækan mun á hverjum hópi G. duodenalis og pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 jardine hópnum, $$P<0.01 og $$$P<0.001.c Sníkjudýraálag var ákvarðað með því að telja fjölda sníkjudýra í 1 ml af skeifugarnarskolun úr skeifugörn (3 cm langur) og gefinn upp sem fjöldi sníkjudýra á cm skeifugörn.Munur á G. duodenalis sýkingarhópnum, pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine hópnum og pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine hópnum var greindur með einstefnu ANOVA með SPSS hugbúnaðarútgáfu 22.0.Stjörnumerki gefa til kynna marktækan mun við **P<0,01 og ***P<0,001.d Vefjameinafræðilegar breytingar í skeifugörn.Rauðar örvar gefa til kynna skemmdir á villi, grænar örvar benda til skemmda á crypts.Mælikvarðarstöng: 100 µm.e, f Tölfræðileg greining á hæð skeifugörn músa villus (e) og crypt hæð (f).Mismunur á milli hópa á mynd 1d var greindur með einstefnu ANOVA með SPSS hugbúnaðarútgáfu 22.0.Stjörnumerki gefa til kynna marktækan mun við *P<0,05 og **P<0,01.Niðurstöður sjö óháðra líffræðilegra tilrauna.ns, ekki marktækt (P > 0,05)
Giardia skeifugörn er vel þekkt þarmasníkjudýr í mönnum og öðrum spendýrum sem veldur giardiasis.Árið 2004 var það innifalið í WHO átakinu um vanrækslu sjúkdóma vegna mikillar útbreiðslu í 6 ár, sérstaklega í samfélögum með lága félagslega efnahagslega stöðu [32].Meðfædda ónæmiskerfið gegnir mikilvægu hlutverki í ónæmissvörun við G. duodenalis sýkingu.Greint hefur verið frá því að átfrumur músa gleypi og drepi G. duodenalis með því að losa utanfrumugildrur [33].Fyrri rannsóknir okkar hafa sýnt að G. duodenalis, sem er ekki ífarandi utanfrumu sníkjudýr, virkjar p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 og NLRP3 bólguboðaleiðir í átfrumum músa til að stjórna bólguviðbrögðum hýsils og losað GEV getur aukið þetta ferli.13], 24].Hins vegar á eftir að skýra nákvæmlega PAMPs sem taka þátt í NLRP3 bólgustýrðri bólgu í GEV og hlutverk NLRP3 inflammasome í giardiasis.Til að varpa ljósi á þessar tvær spurningar gerðum við þessa rannsókn.
NLRP3 inflammasome er staðsett í umfrymi ónæmisfrumna og getur verið virkjað af ýmsum ögnum eins og þvagsýrukristöllum, eiturefnum, bakteríum, vírusum og sníkjudýrum.Í bakteríurannsóknum hafa eiturefni verið skilgreind sem lykil PAMP sem virkja bólguskynjara, sem leiðir til bólgu og frumudauða [34].Sum byggingarfræðilega fjölbreytt eiturefni, eins og hemolysin frá Staphylococcus aureus [35] og Escherichia coli [36], hemolysin BL (HBL) frá enterotoxin (NHE) [37], örva virkjun NLRP3 bólgu.Veirurannsóknir hafa sýnt að meinvirkniprótein eins og SARS-COV-2 hjúp (E) prótein [38] og Zika veiru NS5 prótein [39] eru mikilvæg PAMP sem þekkjast af NLRP3 viðtakanum.Í rannsóknum á sníkjudýrum hefur verið greint frá mörgum sníkjudýrum sem tengjast virkjun bólgueyðandi hýsils, svo sem Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] og Leishmania [42].Þéttu kyrnupróteinin GRA35, GRA42 og GRA43, sem tengjast meinvirkni Toxoplasma gondii, eru nauðsynleg til að framkalla pyroptosis í Lewis rottum átfrumum [43].Að auki hafa sumar Leishmania rannsóknir beinst að einstökum sameindum sem taka þátt í NLRP3 inflammasome, svo sem sníkjudýr himnu lipophosphoglycan [44] eða sink metallopróteasa [45].Meðal annexín-líka alfa-giardin fjölskyldu gena hefur verið sýnt fram á að alfa-1 giardin sé hugsanlegur bóluefnisframbjóðandi sem veitir vernd gegn G. duodenalis í músamódeli [18].Í rannsókn okkar völdum við G. duodenalis meinvirkniþætti alfa-2 og alfa-7,3 giardines, sem eru einstakir fyrir giardia en hlutfallslega minna greint frá.Þessi tvö markgen voru klónuð inn í pcDNA3.1(+) heilkjörnungatjáningarkerfisferjuna til greiningar á bólguvirkjun.
Í músamódelinu okkar þjóna klofnir kaspasabútar sem merki um bólguvirkjun.Við örvun hefur NLRP3 samskipti við ASC, nýtir procaspasa og myndar virka caspasa sem kljúfa pro-IL-1β og pro-IL-18 í þroskað IL-1β og IL-18, í sömu röð -18.Bólgueyðandi kaspasar (kaspasar-1, -4, -5 og -11) eru varðveitt fjölskylda cysteinpróteasa sem eru mikilvæg fyrir meðfædda vörn og taka þátt í bólgu og forrituðum frumudauða [46].Caspase-1 er virkjað af kanónískum bólgueyðingum [47], á meðan kaspasar-4, -5 og -11 eru klofnir við myndun óhefðbundinna bólgueyðandi efna [48].Í þessari rannsókn notuðum við kviðfrumur músa sem fyrirmynd og könnuðum p20 caspase-1 klofnað caspase-1 sem merki um NLRP3 bólguvirkjun hýsils í rannsóknum á G. duodenalis sýkingu.Niðurstöðurnar sýndu að mörg alfa-giardín eru ábyrg fyrir dæmigerðri virkjun bólgu, sem er í samræmi við uppgötvun helstu meinvirknisameinda sem taka þátt í bakteríum og veirum.Hins vegar er rannsóknin okkar aðeins bráðabirgðaskönnun og það eru aðrar sameindir sem geta virkjað óklassísk bólgueyðandi, þar sem fyrri rannsókn okkar fann bæði klassísk og óklassísk bólgueyðandi í G. duodenalis sýkingu [13].Til að ákvarða enn frekar hvort myndaður p20 kaspasi-1 tengist NLRP3 bólgum, fluttum við alfa-2 og alfa-7.3 giardín inn í kviðhimnuátfrumur músa til að ákvarða tjáningargildi lykilsameinda próteina og ASC fáliðunarstig, sem staðfestir að bæði α-giardín virkjast bólgueyðandi NLRP3.Niðurstöður okkar eru aðeins frábrugðnar niðurstöðum Manko-Prykhoda o.fl., sem greindu frá því að örvun á Caco-2 frumum með G. muris eða E. coli EPEC stofnum einum og sér getur aukið flúrljómunarstyrk NLRP3, ASC og caspase-1, þó ekki marktækt, en hvernig samörvun G. muris og E. coli jók magn þriggja próteina [49].Þetta misræmi getur stafað af mismunandi vali á Giardia tegundum, frumulínum og frumfrumum.Við gerðum einnig in vivo mælingar með MCC950 í 5 vikna gömlum WT C57BL/6 kvenkyns músum, sem eru næmari fyrir G. duodenalis.MCC950 er öflugur og sértækur NLRP3 hemill með litlum sameindum sem hindrar kanóníska og ógilda NLRP3 virkjun við nanómólstyrk.MCC950 hamlar NLRP3 virkjun en hefur ekki áhrif á virkjun AIM2, NLRC4 og NLRP1 bólguferla eða TLR merkjaferla [27].MCC950 hindrar NLRP3 virkjun en hindrar ekki NLRP3 upphaf, K+ útflæði, Ca2+ innflæði eða samspil NLRP3 og ASC;þess í stað hindrar það NLRP3 bólgueyðandi virkjun með því að hindra ASC oligomerization [27].Þess vegna notuðum við MCC950 í in vivo rannsókn til að ákvarða hlutverk NLRP3 inflammasome eftir giardine inndælingu.Virkjað caspase-1 p10 klýfur bólgueyðandi frumudrep pro-IL-1β og pro-IL-18 í þroskað IL-1β og IL-18 [50].Í þessari rannsókn var styrkur IL-1β í sermi í músum sem fengu giardín með eða án MCC950 notaðar sem vísbending um hvort NLRP3 bólgueyðandi var virkjað.Eins og búist var við dró MCC950 meðferð verulega úr IL-1β í sermi.Þessar upplýsingar sýna greinilega fram á að G. duodenalis giardin alfa-2 og giardin alfa-7.3 geta virkjað NLRP3 músabólga.
Mikilvægar upplýsingar sem safnast hafa upp undanfarinn áratug hafa sýnt fram á að IL-17A er aðal eftirlitsaðili ónæmis gegn G. muris, sem örvar IL-17RA boð, framleiðir örverueyðandi peptíð og stjórnar komplement virkjun [51].Hins vegar kemur Giardia sýking oftar fram hjá ungum fullorðnum og það hefur verið greint frá því að Giardia sýking í ungum músum virkjar ekki IL-17A svörun til að beita verndandi áhrifum sínum [52], sem hvetur vísindamenn til að leita að öðrum ónæmisbælandi Giardia.aðferðir helminth sýkingar.Höfundar nýlegrar rannsóknar greindu frá því að G. muris geti virkjað NLRP3 inflammasome af E. coli EPEC, sem stuðlar að framleiðslu örverueyðandi peptíða og dregur úr tengingargetu þess og fjölda trophozoites í meltingarvegi, og dregur þannig úr alvarleika ristilsins. sjúkdómar af völdum bacilli [49].NLRP3 inflammasome tekur þátt í þróun ýmissa sjúkdóma.Rannsóknir hafa sýnt að Pseudomonas aeruginosa kveikir á sjálfsát í átfrumum til að forðast frumudauða, og þetta ferli er háð virkjun NLRP3 inflammasomes [53].Fyrir N. caninum takmarkar hvarfgjörn súrefnistegundamiðluð virkjun NLRP3 bólgueyðingarinnar afritun þess í hýsilinn, sem gerir það að hugsanlegu lækningamarkmiði [9].Sýnt hefur verið fram á að Paracoccidioides brasiliensis örvar virkjun NLRP3 inflammasomes í beinmergsfrumum úr músum, sem leiðir til losunar bólgusýtókínsins IL-1β, sem gegnir mikilvægu hlutverki í vörn hýsils [10].Nokkrar Leishmania tegundir, þar á meðal L. amazonensis, L. major, L. braziliensis og L. infantum chagasi, virkja NLRP3 og ASC-háðan caspase-1 í átfrumum, auk Leishmania sýkingar.Afritun sníkjudýra er aukin í músum sem skortir NLRP3/ASC/caspase-1 geninu [11].Zamboni o.fl.Greint hefur verið frá því að Leishmania sýking framkalli virkjun NLRP3 inflammasome í átfrumum, sem takmarkar eftirmyndun sníkjudýra innan frumu.Þannig getur Leishmania hindrað NLRP3 virkjun sem forðast aðferð.Í in vivo rannsóknum stuðlaði NLRP3 inflammasome til brotthvarfs Leishmania, en hafði ekki áhrif á vefi [54].Aftur á móti, í helminthiasis rannsóknum, bældi virkjun NLRP3 inflammasome verndandi ónæmi hýsilsins gegn helminthiasis í meltingarvegi [12].Shigella er ein helsta bakterían sem veldur niðurgangi um allan heim.Þessar bakteríur geta framkallað IL-1β framleiðslu með P2X7 viðtakamiðluðu K+ útflæði, hvarfgjörnum súrefnistegundum, leysisýrnun og hvatberaskemmdum.NLRP3 inflammasome stjórnar átfrumum og bakteríudrepandi virkni átfrumna á neikvæðan hátt gegn Shigella [55].Plasmodium rannsóknir hafa sýnt að AIM2, NLRP3 eða caspase-1 skort mýs sýktar af Plasmodium framleiða mikið magn af tegund 1 interferóni og eru ónæmari fyrir Plasmodium sýkingu [56].Hins vegar er hlutverk alfa-2 giardíns og alfa-7.3 giardíns við að örva sjúkdómsvaldandi virkjun NLRP3 bólgu í músum óljóst.
Í þessari rannsókn minnkaði hömlun NLRP3 inflammasomes af MCC950 BW og jók fjölda trophozoites í þarmaskolunarvökva í músum, sem leiddi til alvarlegri meinafræðilegra breytinga í skeifugarnarvef.Alfa-2 giardín og alfa-7.3 giardín virkja NLRP3 inflammasome hýsilmúsarinnar, auka líkamsþyngd músa, fækka trophozoites í þarmaskolunarvökva og draga úr sjúklegum skeifugarnarskemmdum.Þessar niðurstöður benda til þess að G. duodenalis geti virkjað NLRP3 hýsilbólga með alfa-2 giardíni og alfa-7,3 giardíni og dregið úr sjúkdómsvaldandi áhrifum G. duodenalis í músum.
Samanlagt sýna niðurstöður okkar að alfa-2 og alfa-7.3 giardín örva virkjun NLRP3 hýsilbólga og draga úr sýkingargetu G. duodenalis í músum.Þess vegna eru þessar sameindir efnileg markmið til að koma í veg fyrir giardiasis.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: yfirlit.Nýlega kom í ljós að Pat Inflamm er með ofnæmi fyrir lyfjum.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: endurskoðun á lyfjameðferð.Sérfræðiálit lyfjafræðings.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, lyfjaónæmi og uppgötvun nýrra skotmarka.Sýkir Disord lyfjamarkmið.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, osfrv NLRP3 bólgu- og bólgusjúkdómar.Oxide Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Hlutverk inflammasome í þarmabólgu og krabbameini.Meltingarlækningar.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Kanónísk og óhefðbundin NLRP3 bólgueyðandi virkjun á krossgötum ónæmisþols og þarmabólgu.fyrirfram ónæmi.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, o.fl.ROS-miðluð NLRP3 inflammasome virkjun tekur þátt í svörun við N. caninum sýkingu.Sníkjudýr vektor.2020;13:449.