Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com.Vafraútgáfan sem þú notar hefur takmarkaðan CSS stuðning.Til að fá bestu upplifunina mælum við með því að þú notir uppfærðan vafra (eða slökkva á eindrægnistillingu í Internet Explorer).Í millitíðinni, til að tryggja áframhaldandi stuðning, munum við gera síðuna án stíla og JavaScript.
Genferjur til meðhöndlunar á blöðruhálskirtli í lungum verða að miða á leiðandi öndunarvegi, þar sem útlæg lungnaflutningur hefur engin lækningaleg áhrif.Skilvirkni veiruflutnings er beintengd við dvalartíma burðarberans.Hins vegar dreifist afhendingarvökvi eins og genaberar náttúrulega inn í lungnablöðrurnar við innöndun og lækningaagnir af hvaða lögun sem er eru fljótt fjarlægðar með slímhúð.Lenging dvalartíma genabera í öndunarfærum er mikilvæg en erfitt að ná.Bærasamtengingar segulmagnaðir agnir sem hægt er að beina að yfirborði öndunarfæra geta bætt svæðismiðun.Vegna vandamála með in vivo myndgreiningu er hegðun slíkra lítilla segulmagnaðir agna á yfirborði öndunarvegarins í návist beitt segulsviðs illa skilin.Markmið þessarar rannsóknar var að nota synchrotron myndgreiningu til að sjá fyrir in vivo hreyfingu röð segulmagnaðir agna í barka svæfðra rotta til að rannsaka gangverki og hegðunarmynstur stakra agna og magnagna in vivo.Við metum síðan líka hvort afhending lentiveiru segulmagnaðir agnir í viðurvist segulsviðs myndi auka skilvirkni flutnings í rottubarka.Synchrotron röntgenmyndataka sýnir hegðun segulmagnaðir agna í kyrrstæðum og hreyfanlegum segulsviðum in vitro og in vivo.Ekki er auðvelt að draga agnir yfir yfirborð lifandi öndunarvega með seglum, en við flutning safnast útfellingar í sjónsviðið þar sem segulsviðið er sterkast.Sendingarskilvirkni jókst einnig sexfalt þegar lentiveiru segulmagnaðir agnir voru afhentar í nærveru segulsviðs.Samanlagt benda þessar niðurstöður til þess að lentiveiru segulmagnaðir agnir og segulsvið geti verið dýrmætar aðferðir til að bæta miðun á genaferjurum og flutningsstig í leiðandi öndunarvegi in vivo.
Cystic fibrosis (CF) stafar af breytingum á einu geni sem kallast CF transmembrane conductance regulator (CFTR).CFTR próteinið er jónaganga sem er til staðar í mörgum þekjufrumum um allan líkamann, þar á meðal öndunarvegi, sem er stór staður í meingerð slímseigjusjúkdóms.Gallar í CFTR leiða til óeðlilegs vatnsflutnings, ofþornunar á yfirborði öndunarvegar og minnkaðrar dýpt öndunaryfirborðs vökvalags (ASL).Það skerðir einnig getu slímhúðarflutningskerfisins (MCT) til að hreinsa öndunarvegi fyrir innönduðum ögnum og sýkla.Markmið okkar er að þróa lentiveiru (LV) genameðferð til að skila réttu afriti af CFTR geninu og bæta ASL, MCT og lungnaheilsu, og halda áfram að þróa nýja tækni sem getur mælt þessar breytur in vivo1.
LV ferjur eru einn af leiðandi frambjóðendum fyrir genameðferð með slímseigjusjúkdómum, aðallega vegna þess að þeir geta varanlega samþætt lækningagenið í grunnfrumur í öndunarvegi (stofnfrumur í öndunarvegi).Þetta er mikilvægt vegna þess að þeir geta endurheimt eðlilega vökva og slímúthreinsun með því að aðgreina sig í starfhæfar genaleiðréttar yfirborðsfrumur í öndunarvegi sem tengjast slímseigjusjúkdómi, sem leiðir til lífslangs ávinnings.LV ferjur verða að beina gegn leiðandi öndunarvegi, þar sem það er þar sem lungnaþátttaka í CF hefst.Sending ferjunnar dýpra í lungun getur leitt til lungnablöðruflutnings, en það hefur engin meðferðaráhrif við slímseigjusjúkdóm.Hins vegar flytjast vökvar eins og genaberar náttúrulega inn í lungnablöðrurnar þegar þeim er andað að sér eftir fæðingu3,4 og lækningaagnir eru hraðvirkar út í munnholið með MCTs.Skilvirkni LV flutnings er í beinu sambandi við þann tíma sem ferjan helst nálægt markfrumunum til að leyfa frumuupptöku – „dvalartími“ 5 sem styttist auðveldlega með dæmigerðu svæðisbundnu loftflæði sem og samræmdri upptöku slíms og MCT agna.Fyrir slímseigjusjúkdóm er hæfileikinn til að lengja LV dvalartíma í öndunarvegi mikilvægur til að ná háum flutningi á þessu svæði, en hefur hingað til verið krefjandi.
Til að yfirstíga þessa hindrun leggjum við til að LV segulmagnaðir agnir (MPs) geti hjálpað á tvo aðra vegu.Í fyrsta lagi er hægt að stýra þeim með segli að yfirborði öndunarvegarins til að bæta miðun og hjálpa genaberandi ögnum að vera á réttu svæði í öndunarvegi;og ASL) færast inn í frumulag 6. MPs eru mikið notaðir sem miðuð lyfjagjöf þegar þeir bindast mótefnum, krabbameinslyfjum eða öðrum litlum sameindum sem festast við frumuhimnur eða bindast viðkomandi frumuyfirborðsviðtökum og safnast fyrir á æxlisstöðum í tilvist stöðurafmagns.Segulsvið til krabbameinsmeðferðar 7. Aðrar „ofhita“ aðferðir miða að því að drepa æxlisfrumur með því að hita þingmenn þegar þeir verða fyrir sveiflu segulsviðum.Meginreglan um segulskipti, þar sem segulsvið er notað sem flutningsmiðill til að auka flutning DNA inn í frumur, er almennt notuð in vitro með því að nota fjölda genaferja sem ekki eru veiru og veiru fyrir frumulínur sem erfitt er að umbreyta. ..Skilvirkni LV segulflutnings með afhendingu LV MP in vitro inn í frumulínu af berkjuþekju úr mönnum í viðurvist kyrrstætts segulsviðs var staðfest, sem jók skilvirkni flutningsins um 186 sinnum samanborið við LV vektorinn einn.LV MT hefur einnig verið notað á in vitro líkan af slímseigjusjúkdómi, þar sem segulmagnaðir transfection jók LV transduction í loft-vökva tengiræktum um stuðullinn 20 í nærveru slímseigjuslímuhráka10.Hins vegar hefur in vivo segulflutningur líffæra fengið tiltölulega litla athygli og hefur aðeins verið metin í nokkrum dýrarannsóknum11,12,13,14,15, sérstaklega í lungum16,17.Hins vegar eru möguleikar á segulsmiti í lungnameðferð við slímseigjusjúkdómum ljósir.Tan o.fl.(2020) lýsti því yfir að „fullgildingarrannsókn á skilvirkri afhendingu segulmagnaðir nanóagna í lungum mun ryðja brautina fyrir framtíðar CFTR innöndunaraðferðir til að bæta klínískar niðurstöður hjá sjúklingum með slímseigjusjúkdóm“6.
Erfitt er að sjá og rannsaka hegðun lítilla segulmagnaðir agna á yfirborði öndunarveganna í viðurvist beitts segulsviðs og því er illa skilið.Í öðrum rannsóknum höfum við þróað Synchrotron Propagation Based Phase Contrast X-Ray Imaging (PB-PCXI) aðferð fyrir ekki ífarandi myndgreiningu og magngreiningu á mínútum in vivo breytingum á ASL18 dýpt og MCT19 hegðun,20 til að mæla beint vökvun á yfirborði gasrásar. og er notað sem snemmbúinn vísbending um árangur meðferðar.Að auki notar MCT stigaaðferðin okkar agnir með 10–35 µm þvermál sem samanstanda af súráli eða gleri með háum brotstuðul sem MCT merki sem sjást með PB-PCXI21.Báðar aðferðirnar henta til að mynda ýmsar agnagerðir, þar á meðal þingmenn.
Vegna mikillar staðbundinnar og tímabundinnar upplausnar eru PB-PCXI-undirstaða ASL og MCT próf vel til þess fallin að rannsaka gangverki og hegðunarmynstur stakra agna og magn agna in vivo til að hjálpa okkur að skilja og hámarka afhendingaraðferðir MP gena.Nálgunin sem við notum hér er byggð á rannsóknum okkar með því að nota SPring-8 BL20B2 geislalínuna, þar sem við sáum hreyfingu vökva eftir afhendingu skammts af líknarferju í nef- og lungnaönd músa til að hjálpa til við að útskýra misleitt genatjáningarmynstur okkar sem sést. í geninu okkar.dýrarannsóknir með burðarskammti upp á 3,4.
Markmið þessarar rannsóknar var að nota PB-PCXI synchrotron til að sjá hreyfingar í lífi röð þingmanna í barka lifandi rotta.Þessar PB-PCXI myndarannsóknir voru hannaðar til að prófa MP röð, segulsviðsstyrk og staðsetningu til að ákvarða áhrif þeirra á MP hreyfingu.Við gerðum ráð fyrir því að ytra segulsvið myndi hjálpa MF sem afhent var að haldast eða færa sig á marksvæðið.Þessar rannsóknir gerðu okkur einnig kleift að ákvarða segulstillingar sem hámarka magn agna sem eru eftir í barka eftir útfellingu.Í annarri röð rannsókna var stefnt að því að nota þessa bestu stillingu til að sýna fram á flutningsmynstrið sem stafar af in vivo afhendingu LV-MPs í öndunarvegi rotta, á þeirri forsendu að afhending LV-MPs í samhengi við öndunarmiðun myndi leiða til í aukinni LV transduction skilvirkni..
Allar dýrarannsóknir voru gerðar í samræmi við samskiptareglur samþykktar af háskólanum í Adelaide (M-2019-060 og M-2020-022) og SPring-8 Synchrotron dýrasiðanefnd.Tilraunirnar voru gerðar í samræmi við ráðleggingar ARRIVE.
Allar röntgenmyndir voru teknar við BL20XU geislalínuna við SPring-8 samstillingu í Japan með sambærilegri uppsetningu og áður var lýst21,22.Í stuttu máli var tilraunakassinn staðsettur 245 m frá synchrotron geymsluhringnum.0,6 m fjarlægð frá sýni til skynjara er notuð fyrir agnamyndatökurannsóknir og 0,3 m fyrir in vivo myndgreiningarrannsóknir til að skapa fasa skuggaáhrif.Notaður var einlitur geisli með 25 keV orku.Myndirnar voru teknar með því að nota háupplausn röntgengeisla (SPring-8 BM3) tengdan sCMOS skynjara.Umbreytirinn breytir röntgengeislum í sýnilegt ljós með því að nota 10 µm þykkan cintillator (Gd3Al2Ga3O12), sem síðan er beint að sCMOS skynjaranum með því að nota ×10 (NA 0,3) smásjárhlutfall.sCMOS skynjarinn var Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) með fylkisstærð 2048 × 2048 dílar og óunnin pixlastærð 6,5 × 6,5 µm.Þessi stilling gefur áhrifaríka ísótrópíska pixlastærð upp á 0,51 µm og sjónsvið um það bil 1,1 mm × 1,1 mm.Lýsingartíminn 100 ms var valinn til að hámarka merki-til-suð hlutfall segulmagnaðir agna innan og utan öndunarvega á meðan að lágmarka hreyfingar sem orsakast af öndun.Fyrir in vivo rannsóknir var hraður röntgenlokari settur í röntgenbrautina til að takmarka geislaskammtinn með því að loka fyrir röntgengeislann á milli útsetningar.
LV miðill var ekki notaður í neinum SPring-8 PB-PCXI myndgreiningarrannsóknum vegna þess að BL20XU myndhólfið er ekki líföryggisstig 2 vottað.Þess í stað völdum við úrval af vel einkennandi þingmönnum frá tveimur söluaðilum sem ná yfir mismunandi stærðir, efni, járnstyrk og notkun, fyrst til að skilja hvernig segulsvið hafa áhrif á hreyfingu þingmanna í glerháræðum, og síðan í lifandi öndunarvegi.yfirborð.Stærð MP er breytileg frá 0,25 til 18 µm og er gerð úr ýmsum efnum (sjá töflu 1), en samsetning hvers sýnis, þar með talið stærð segulagnanna í MP, er óþekkt.Byggt á umfangsmiklum MCT rannsóknum okkar 19, 20, 21, 23, 24, gerum við ráð fyrir að þingmenn niður í 5 µm sjáist á yfirborði barka öndunarvegar, til dæmis með því að draga frá samfellda ramma til að sjá betri sýnileika MP hreyfingar.Einn MP upp á 0,25 µm er minni en upplausn myndgreiningartækisins, en búist er við að PB-PCXI greini rúmmálsskilgreiningu þeirra og hreyfingu yfirborðsvökvans sem þau eru sett á eftir að hafa verið sett.
Sýnishorn fyrir hvern þingmann í töflunni.1 var útbúið í 20 μl glerháræðum (Drummond Microcaps, PA, USA) með innra þvermál 0,63 mm.Corpuscular agnir eru fáanlegar í vatni en CombiMag agnir eru fáanlegar í eigin vökva framleiðanda.Hver túpa er hálffyllt með vökva (u.þ.b. 11 µl) og sett á sýnishaldarann ​​(sjá mynd 1).Glerháræðunum var komið fyrir lárétt á sviðinu í myndhólfinu, hver um sig, og staðsett við brúnir vökvans.19 mm þvermál (28 mm langur) nikkel-skel segull úr sjaldgæfum jarðvegi, neodymium, járni og bór (NdFeB) (N35, vörunúmer LM1652, Jaycar Electronics, Ástralíu) með endurlífgun upp á 1,17 T var festur við a aðskilin flutningstöflu til að ná. Fjarlægðu stöðu þína meðan á flutningi stendur.Röntgenmyndataka hefst þegar segullinn er staðsettur um það bil 30 mm fyrir ofan sýnið og myndir eru teknar með 4 ramma á sekúndu.Við myndatöku var segullinn færður nálægt glerháræðarörinu (í um það bil 1 mm fjarlægð) og síðan færður meðfram rörinu til að meta áhrif sviðsstyrks og stöðu.
In vitro myndgreiningaruppsetning sem inniheldur MP sýni í glerháræðum á þýðingarstigi xy sýnisins.Slóð röntgengeislans er merkt með rauðri punktalínu.
Þegar sýnileiki þingmanna í glasi var staðfestur var hlutmengi þeirra prófaður in vivo á villigerð kvenkyns Wistar albínórottum (~12 vikna gamlar, ~200 g).Medetomidín 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japan), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) og bútorfanól 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Rottur voru svæfðar með Pharma (Japan) blöndu með inndælingu í kviðarhol.Eftir svæfingu voru þeir undirbúnir fyrir myndgreiningu með því að fjarlægja feldinn í kringum barkann, setja inn barkarör (ET; 16 Ga í bláæð, Terumo BCT) og kyrrsetja þá í liggjandi stöðu á sérsmíðaðri myndplötu sem inniheldur hitapoka. til að viðhalda líkamshita.22. Myndgreiningarplatan var síðan fest við sýnisstigið í myndaboxinu í smá halla til að stilla barkanum lárétt á röntgenmyndina eins og sýnt er á mynd 2a.
(a) Uppsetning in vivo myndatöku í SPring-8 myndgreiningareiningunni, röntgengeislaslóð merkt með rauðri punktalínu.(b,c) Staðsetning barka seguls var framkvæmd fjarstýrð með því að nota tvær hornrétt uppsettar IP myndavélar.Vinstra megin á myndinni á skjánum er hægt að sjá vírlykkjuna sem heldur hausnum og inngjafarholuna setta upp í ET rörinu.
Fjarstýrt sprautudælukerfi (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) með 100 µl glersprautu var tengt við PE10 slöngu (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) með 30 Ga nál.Merktu slönguna til að tryggja að oddurinn sé í réttri stöðu í barkanum þegar barkarörið er komið fyrir.Með því að nota ördælu var sprautustimpillinn fjarlægður og oddurinn á túpunni sökkt í MP sýninu sem á að gefa.Hlaðna afhendingarslöngunni var síðan stungið inn í barkahólkinn og oddurinn settur á sterkasta hlutann á væntanlegu segulsviði okkar.Myndatöku var stjórnað með því að nota öndunarskynjara sem tengdur var við Arduino tímatökuboxið okkar og öll merki (td hitastig, öndun, opnun/loka lokar og myndatöku) voru skráð með Powerlab og LabChart (AD Instruments, Sydney, Ástralíu) 22 Við myndatöku Þegar húsið var ekki tiltækt voru tvær IP myndavélar (Panasonic BB-SC382) staðsettar í u.þ.b. 90° á hvor aðra og notaðar til að stjórna stöðu segulsins miðað við barkann við myndatöku (Mynd 2b, c).Til að lágmarka hreyfingargripi var tekin ein mynd á hvern andardrætti á lokastigi öndunarflæðis.
Segullinn er festur við annað þrepið, sem getur verið staðsett utan á myndlíkama.Ýmsar stöður og stillingar segulsins voru prófaðar, þar á meðal: settur í um það bil 30° horn fyrir ofan barkann (stillingar eru sýndar á myndum 2a og 3a);einn segull fyrir ofan dýrið og hinn fyrir neðan, með skautunum stillt fyrir aðdráttarafl (Mynd 3b)., einn segull fyrir ofan dýrið og einn fyrir neðan, með skautunum stillt til að hrinda frá sér (Mynd 3c), og einn segull fyrir ofan og hornrétt á barkann (Mynd 3d).Eftir að hafa sett upp dýrið og segulinn og hlaðið MP sem verið er að prófa í sprautudæluna, gefðu 50 µl skammt á hraðanum 4 µl/sek við myndatöku.Segullinn er síðan færður fram og til baka meðfram eða yfir barkann á meðan hann heldur áfram að taka myndir.
Segulstilling fyrir in vivo myndgreiningu (a) einn segull fyrir ofan barka í um það bil 30° horn, (b) tveir seglar stilltir fyrir aðdráttarafl, (c) tveir seglar stilltir fyrir fráhrindingu, (d) einn segull fyrir ofan og hornrétt á barka.Áhorfandinn horfði niður frá munni til lungna í gegnum barkann og röntgengeislinn fór í gegnum vinstri hlið rottunnar og fór út úr hægri hliðinni.Segullinn er ýmist færður eftir endilöngu öndunarvegi eða til vinstri og hægri fyrir ofan barkann í átt að röntgengeislanum.
Við leituðumst einnig við að ákvarða sýnileika og hegðun agna í öndunarvegi án blöndunar öndunar og hjartsláttartíðar.Þess vegna, í lok myndgreiningartímabilsins, voru dýr aflífuð á mannúðlegan hátt vegna ofskömmtunar pentobarbitals (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, Bandaríkjunum; ~65 mg/kg ip).Sum dýr voru skilin eftir á myndgreiningarpallinum og eftir að öndun og hjartsláttur var hætt var myndgreiningarferlið endurtekið og bætt við aukaskammti af MP ef enginn MP sást á yfirborði öndunarvegarins.
Myndirnar sem fengust voru leiðréttar fyrir flatt og dökkt svið og síðan settar saman í kvikmynd (20 rammar á sekúndu; 15–25 × eðlilegur hraði eftir öndunarhraða) með sérsniðnu handriti skrifað í MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Allar rannsóknir á sendingu LV genaferja voru gerðar við rannsóknarstofu dýrarannsóknamiðstöðvar háskólans í Adelaide og miðuðu að því að nota niðurstöður SPring-8 tilraunarinnar til að meta hvort sending LV-MP í nærveru segulsviðs gæti aukið genaflutning in vivo .Til að meta áhrif MF og segulsviðs voru tveir hópar dýra meðhöndlaðir: annar hópurinn var sprautaður með LV MF með segulstaðsetningu og hinn hópurinn var sprautaður með samanburðarhópi með LV MF án seguls.
LV genaferjur hafa verið búnar til með því að nota áður lýstar aðferðir 25, 26.LacZ ferjan tjáir kjarna staðbundið beta-galaktósíðasa gen sem knúið er áfram af MPSV constitutive promoter (LV-LacZ), sem framleiðir bláa hvarfafurð í transduced frumum, sýnilegt á framhliðum og hluta lungnavefsins.Títrun var framkvæmd í frumuræktun með því að telja fjölda LacZ-jákvæðra frumna handvirkt með því að nota blóðfrumnamæli til að reikna títruna í TU/ml.Flytjurnar eru frystar við -80°C, þiðnar fyrir notkun og bundnar við CombiMag með því að blanda 1:1 og rækta á ís í að minnsta kosti 30 mínútur fyrir afhendingu.
Venjulegar Sprague Dawley rottur (n = 3/hópur, ~2-3 svæfðar ip með blöndu af 0,4mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Ástralía) og 60mg/kg ketamín (Ilium, Ástralía) við 1 mánaðar aldur) ip ) inndælingu og munnæð án skurðaðgerðar með 16 Ga í bláæð.Til að tryggja að vefur í öndunarvegi í barka fái LV transduction, var hann stilltur með því að nota áður lýstar vélrænni truflunarreglur okkar þar sem yfirborð barka öndunarvegar var nuddað áslega með vírkörfu (N-Circle, nitinol stone extractor without tip NTSE-022115 ) -UDH , Cook Medical, Bandaríkjunum) 30 bls.28.Síðan, um 10 mínútum eftir truflun í líföryggisskápnum, var gjöf LV-MP í barka framkvæmd.
Segulsviðið sem notað var í þessari tilraun var stillt á svipaðan hátt og í in vivo röntgenrannsókn, með sömu seglum sem haldið var yfir barka með eimingarstentsklemmum (Mynd 4).50 µl rúmmál (2 x 25 µl skammtar) af LV-MP var gefið í barkann (n = 3 dýr) með því að nota hlauppípettu eins og áður hefur verið lýst.Samanburðarhópurinn (n = 3 dýr) fékk sama LV-MP án þess að nota segul.Eftir að innrennsli er lokið er holnálin fjarlægð úr barkarörinu og dýrið stækkað.Segullinn helst á sínum stað í 10 mínútur áður en hann er fjarlægður.Rottum var gefið undir húð með meloxicami (1 ml/kg) (Ilium, Ástralía) fylgt eftir með svæfingu með inndælingu 1 mg/kg atipamazólhýdróklóríðs í kviðarhol (Antisedan, Zoetis, Ástralía).Rottum var haldið heitum og fylgst með þeim þar til þær höfðu náð sér að fullu eftir svæfingu.
LV-MP afhendingartæki í líffræðilegum öryggisskáp.Þú getur séð að ljósgrá Luer-lock ermi ET slöngunnar stendur út úr munninum og gelpípettuoddurinn sem sýndur er á myndinni er settur í gegnum ET slönguna að æskilegu dýpi í barkann.
Viku eftir gjöf LV-MP var dýrum fórnað á mannúðlegan hátt með innöndun á 100% CO2 og LacZ tjáning var metin með venjulegu X-gal meðferð okkar.Þrír brjóskhringirnir með mestu brjóskinu voru fjarlægðir til að tryggja að allar vélrænar skemmdir eða vökvasöfnun vegna staðsetningar barkaslöngunnar væri ekki með í greiningunni.Hver barki var skorinn langsum til að fá tvo helminga til greiningar og settur í bolla sem innihélt kísillgúmmí (Sylgard, Dow Inc) með Minutien nál (Fine Science Tools) til að sjá yfirborð ljóssins.Dreifing og eðli umritaðra frumna var staðfest með myndatöku að framan með því að nota Nikon smásjá (SMZ1500) með DigiLite myndavél og TCapture hugbúnaði (Tucsen Photonics, Kína).Myndir voru teknar með 20x stækkun (þar á meðal hámarksstilling fyrir alla breidd barkans), þar sem öll lengd barkans birtist skref fyrir skref, sem gefur nægilega skörun á milli hverrar myndar til að hægt sé að „sauma“ myndir.Myndirnar úr hverjum barka voru síðan sameinaðar í eina samsetta mynd með því að nota Composite Image Editor útgáfu 2.0.3 (Microsoft Research) með því að nota planar motion algorithm. Flatarmál LacZ tjáningar innan samsettra barkamynda frá hverju dýri var magnmælt með því að nota sjálfvirkt MATLAB forskrift (R2020a, MathWorks) eins og áður hefur verið lýst28, með stillingum 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 og Value < 0,7. Svæðið LacZ tjáningar innan samsettra barkamynda frá hverju dýri var magnmælt með því að nota sjálfvirkt MATLAB forskrift (R2020a, MathWorks) eins og áður hefur verið lýst28, með stillingum 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15, og Value < 0,7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. Flatarmál LacZ tjáningar í samsettum barkamyndum frá hverju dýri var magnmælt með því að nota sjálfvirkt MATLAB forskrift (R2020a, MathWorks) eins og áður hefur verið lýst28 með stillingum 0,350,15 og gildi<0,7.如 前所 述 ， 使用 自动 Matlab 脚本 （R2020A ， MathWorks） 对 来自 每 只 动物 的 气管 复合 图像 中 的 的 表达 区域 进行 ， ， 使用 的 设置。。 色调 色调 色调 色调 色调 色调。。 的 的 的 的 设置。。。如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（R2020A ， MathWorks） 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 的 表达 ， ， 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 的 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 色调。。。。。。。。。。。。… Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Svæði LacZ tjáningar á samsettum myndum af barka hvers dýrs voru magngreind með sjálfvirku MATLAB forskrift (R2020a, MathWorks) eins og áður hefur verið lýst með stillingum 0,35 < litblær < 0,58, mettun > 0,15 og gildi < 0,7 .Með því að rekja útlínur vefja í GIMP v2.10.24 var gríma búin til handvirkt fyrir hverja samsetta mynd til að bera kennsl á vefsvæðið og koma í veg fyrir rangar greiningar utan barkavefsins.Lituðu svæðin úr öllum samsettum myndum frá hverju dýri voru teknar saman til að gefa heildarlitað svæði fyrir það dýr.Málaða svæðinu var síðan deilt með heildarflatarmáli grímunnar til að fá staðlað svæði.
Hver barki var felldur inn í paraffín og skipt í 5 µm þykkt.Hlutar voru mótlitaðir með hlutlausum hröðum rauðum í 5 mínútur og myndir voru teknar með Nikon Eclipse E400 smásjá, DS-Fi3 myndavél og NIS frumefnisfangahugbúnað (útgáfa 5.20.00).
Allar tölfræðilegar greiningar voru gerðar í GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Tölfræðileg marktækni var stillt á p ≤ 0,05.Eðlileiki var prófaður með Shapiro-Wilk prófinu og munur á LacZ litun var metinn með óparuðu t-prófi.
Þingmennirnir sex sem lýst er í töflu 1 voru skoðaðir með PCXI og sýnileikanum er lýst í töflu 2. Tveir pólýstýren MPs (MP1 og MP2; 18 µm og 0,25 µm, í sömu röð) sáust ekki með PCXI, en hægt var að bera kennsl á sýnin sem eftir voru (dæmi eru sýnd á mynd 5).MP3 og MP4 eru lítið sýnileg (10-15% Fe3O4; 0,25 µm og 0,9 µm, í sömu röð).Þrátt fyrir að MP5 (98% Fe3O4; 0,25 µm) innihélt nokkrar af minnstu agnunum sem prófaðar voru, var það mest áberandi.Það er erfitt að greina á milli CombiMag MP6 vörunnar.Í öllum tilfellum bættist hæfni okkar til að greina MFs til muna með því að færa segullinn fram og til baka samhliða háræðinni.Þegar seglarnir færðust í burtu frá háræðinu voru agnirnar dregnar út í löngum keðjum, en þegar seglarnir nálguðust og segulsviðsstyrkurinn jókst styttist agnakeðjurnar þegar agnirnar fluttu í átt að efra yfirborði háræðsins (sjá viðbótarmyndband S1 : MP4), auka þéttleika agna við yfirborðið.Aftur á móti, þegar segullinn er fjarlægður úr háræðinni, minnkar sviðsstyrkurinn og þingmennirnir endurraða sér í langar keðjur sem ná frá efra yfirborði háræðsins (sjá viðbótarmyndband S2: MP4).Eftir að segullinn hættir að hreyfast halda agnirnar áfram að hreyfast í nokkurn tíma eftir að hafa náð jafnvægisstöðu.Þegar þingmaðurinn færist í átt að og í burtu frá efra yfirborði háræðsins hafa segulmagnaðir agnir tilhneigingu til að draga rusl í gegnum vökvann.
Sýnileiki MP undir PCXI er töluvert mismunandi milli sýna.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 og (d) MP6.Allar myndir sem sýndar eru hér voru teknar með segli sem staðsettur var um það bil 10 mm beint fyrir ofan háræðið.Stóru hringirnir sem virðast vera loftbólur sem eru fastar í háræðunum, sýna greinilega svarta og hvíta brúna eiginleika fasa andstæða myndarinnar.Rauði reiturinn gefur til kynna stækkunina sem eykur birtuskil.Athugið að þvermál segulrásanna á öllum myndum er ekki í mælikvarða og er um það bil 100 sinnum stærri en sýnt er.
Þegar segullinn færist til vinstri og hægri meðfram toppi háræðsins breytist horn MP strengsins þannig að það samræmist seglinum (sjá mynd 6) og afmarkar þannig segulsviðslínurnar.Fyrir MP3-5, eftir að strengurinn nær þröskuldshorninu, draga agnirnar eftir efra yfirborði háræðsins.Þetta leiðir oft til þess að þingmenn flokkast í stærri hópa þar sem segulsviðið er sterkast (sjá aukamyndband S3: MP5).Þetta er líka sérstaklega áberandi þegar myndataka er nálægt enda háræðsins, sem veldur því að MP safnast saman og einbeita sér við vökva-loft tengi.Agnirnar í MP6, sem var erfiðara að greina en þær í MP3-5, drógu ekki þegar segullinn hreyfðist meðfram háræðinni, en MP strengirnir sundruðust og skildu eftir sig agnirnar (sjá aukamyndband S4: MP6).Í sumum tilfellum, þegar beitt segulsvið var minnkað með því að færa seglin um langa vegalengd frá myndatökustaðnum, fóru allir þingmenn sem eftir voru hægt niður á botn yfirborðs rörsins með þyngdaraflinu, eftir í strengnum (sjá viðbótarmyndband S5: MP3) .
Horn MP strengsins breytist þegar segullinn færist til hægri fyrir ofan háræðið.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 og (d) MP6.Rauði reiturinn gefur til kynna stækkunina sem eykur birtuskil.Vinsamlegast athugaðu að viðbótarmyndböndin eru í upplýsingaskyni þar sem þau sýna mikilvæga agnabyggingu og kraftmikla upplýsingar sem ekki er hægt að sjá á þessum kyrrstæðu myndum.
Prófanir okkar hafa sýnt að það að færa segulinn hægt fram og til baka meðfram barkanum auðveldar sýn á MF í samhengi við flókna hreyfingu in vivo.Engar in vivo prófanir voru gerðar vegna þess að pólýstýrenperlur (MP1 og MP2) sáust ekki í háræð.Hver hinna fjögurra MF sem eftir voru var prófuð in vivo með langás segulsins staðsettur yfir barkanum í um það bil 30° horni á lóðréttan (sjá myndir 2b og 3a), þar sem þetta leiddi til lengri MF keðja og var skilvirkari en segull..uppsetningu hætt.MP3, MP4 og MP6 hafa ekki fundist í barka nokkurra lifandi dýra.Þegar öndunarvegur rotta voru sýndir eftir að hafa drepið dýrin á mannúðlegan hátt, héldust agnirnar ósýnilegar jafnvel þegar auknu rúmmáli var bætt við með því að nota sprautudælu.MP5 var með hæsta járnoxíðinnihaldið og var eina sýnilega ögnin, svo hún var notuð til að meta og einkenna MP-hegðun in vivo.
Staðsetning segulsins yfir barkann við innsetningu MF leiddi til þess að mörg, en ekki öll, MF voru einbeitt í sjónsviðinu.Inngangur agna í barka sést best hjá dýrum sem hafa verið aflífuð á mannúðlegan hátt.Mynd 7 og aukamyndband S6: MP5 sýnir hraða segulfanga og röðun agna á yfirborði kviðbarka, sem gefur til kynna að hægt sé að miða þingmenn á æskileg svæði í barka.Þegar leitað var lengra meðfram barkanum eftir MF fæðingu, fundust nokkur MFs nær carina, sem gefur til kynna ófullnægjandi segulsviðsstyrk til að safna og halda öllum MFs, þar sem þau voru afhent í gegnum svæðið með hámarks segulsviðsstyrk við vökvagjöf.ferli.Hins vegar var styrkur MP eftir fæðingu hærri í kringum myndsvæðið, sem bendir til þess að margir þingmenn hafi verið áfram á svæðum í öndunarvegi þar sem beitt segulsviðsstyrkur var hæstur.
Myndir af (a) fyrir og (b) eftir afhendingu MP5 í barka nýlega aflífaðrar rottu með segli staðsettur rétt fyrir ofan myndatökusvæðið.Svæðið á myndinni er staðsett á milli tveggja brjóskhringa.Það er nokkur vökvi í öndunarvegi áður en þingmaðurinn er fæddur.Rauði reiturinn gefur til kynna stækkunina sem eykur birtuskil.Þessar myndir eru teknar úr myndbandinu sem birtist í S6: MP5 viðbótarmyndbandi.
Flutningur segulsins meðfram barkanum in vivo leiddi til breytinga á horni MP-keðjunnar á yfirborði öndunarvegarins, svipað því sem sést í háræðum (sjá mynd 8 og aukamyndband S7: MP5).Hins vegar, í rannsókn okkar, var ekki hægt að draga þingmenn eftir yfirborði lifandi öndunarfæra eins og háræðar gætu gert.Í sumum tilfellum lengist MP keðjan þegar segullinn færist til vinstri og hægri.Athyglisvert er að við komumst líka að því að agnakeðjan breytir dýpt yfirborðslags vökvans þegar segullinn er færður langsum eftir barkanum og stækkar þegar segullinn er færður beint yfir og agnakeðjunni er snúið í lóðrétta stöðu (sjá Viðbótarmyndband S7).: MP5 klukkan 0:09, neðst til hægri).Einkennandi hreyfimynstrið breyttist þegar segullinn var færður til hliðar yfir topp barkans (þ.e. til vinstri eða hægri við dýrið, frekar en eftir endilöngu barkanum).Agnirnar sáust enn vel á meðan á hreyfingu þeirra stóð, en þegar segullinn var fjarlægður úr barkanum urðu oddarnir á agnastrengjunum sýnilegir (sjá viðbótarmyndband S8: MP5, byrjað á 0:08).Þetta er í samræmi við þá hegðun sem sést á segulsviðinu undir virkni beitts segulsviðs í glerháræð.
Dæmi um myndir sem sýna MP5 í barka lifandi svæfðrar rottu.(a) Segullinn er notaður til að ná myndum fyrir ofan og vinstra megin við barkann, síðan (b) eftir að segullinn hefur verið færður til hægri.Rauði reiturinn gefur til kynna stækkunina sem eykur birtuskil.Þessar myndir eru úr myndbandinu í aukavídeói S7: MP5.
Þegar pólarnir tveir voru stilltir í norður-suður stefnu fyrir ofan og neðan barka (þ.e. aðdráttarafl; mynd 3b), virtust MP strengirnir lengri og voru staðsettir á hliðarvegg barkans frekar en á bakyfirborði barkans. barka (sjá viðauka).Myndband S9:MP5).Hins vegar greindist ekki hár styrkur agna á einum stað (þ.e. bakyfirborði barkans) eftir vökvagjöf með tvísegulbúnaði, sem venjulega gerist með einum segulbúnaði.Síðan, þegar einn segull var stilltur til að hrinda frá sér andstæðum pólum (Mynd 3c), jókst fjöldi agna sem sjást í sjónsviðinu ekki eftir afhendingu.Það er krefjandi að setja upp báðar tvær segulstillingarnar vegna mikils segulsviðsstyrks sem laðar að eða ýtir á seglana.Uppsetningunni var síðan breytt í einn segull samsíða öndunarveginum en fór í gegnum öndunarvegina í 90 gráðu horni þannig að kraftlínurnar fóru hornrétt yfir barkavegginn (Mynd 3d), stefnu sem ætlað er að ákvarða möguleika á agnasamsöfnun á hliðarveggurinn.að fylgjast með.Hins vegar, í þessari uppsetningu, var engin auðkennanleg MF uppsöfnunarhreyfing eða segulhreyfing.Byggt á öllum þessum niðurstöðum var uppsetning með einum segul og 30 gráðu stefnu valin fyrir in vivo rannsóknir á genaberum (mynd 3a).
Þegar dýrið var myndað margoft strax eftir mannúðlega fórn, þýddi fjarvera truflandi hreyfingar vefja að hægt var að greina fínni, styttri kornalínur í tæra millibrjósksviðinu, sem „sveifla“ í samræmi við þýðingu segulsins.sjá greinilega nærveru og hreyfingu MP6 agna.
Títri LV-LacZ var 1,8 x 108 ae/ml og eftir blöndun 1:1 við CombiMag MP (MP6) var dýrum sprautað með 50 µl af barkaskammti upp á 9 x 107 ae/ml af LV burðarefni (þ.e. 4,5 x 106 TU/rotta).).).Í þessum rannsóknum, í stað þess að hreyfa segullinn á meðan á fæðingu stendur, festum við seglin í eina stöðu til að ákvarða hvort LV ummyndun gæti (a) verið bætt samanborið við vektorafhendingu í fjarveru segulsviðs og (b) ef öndunarvegurinn gæti vera einbeittur.Frumurnar eru umbreyttar í segulmagnaðir marksvæði efri öndunarveganna.
Tilvist segla og notkun CombiMag í samsettri meðferð með LV-ferjum virtist ekki hafa skaðleg áhrif á heilsu dýra, eins og staðlaða LV-ferjurafhendingaraðferðin okkar gerði.Framhliðarmyndir af barkasvæðinu sem varð fyrir vélrænni truflun (viðbótarmynd 1) sýndu að hópurinn sem fékk LV-MP meðferð hafði marktækt hærra magn af transduction í viðurvist seguls (mynd 9a).Aðeins lítið magn af bláum LacZ litun var til staðar í samanburðarhópnum (Mynd 9b).Magngreining á X-Gal-lituðum eðlilegum svæðum sýndi að gjöf LV-MP í viðurvist segulsviðs leiddi til um það bil 6-faldrar bata (mynd 9c).
Dæmi um samsettar myndir sem sýna barkaflutning með LV-MP (a) í viðurvist segulsviðs og (b) í fjarveru seguls.(c) Tölfræðilega marktæk framför á staðlaðu svæði LacZ flutnings í barka með notkun seguls (*p = 0,029, t-próf, n = 3 á hóp, meðaltal ± staðalvilla meðaltals).
Hlutlausir fljótir rauðlitaðir hlutar (dæmi sýnt á aukamynd 2) bentu til þess að LacZ-litaðar frumur væru til staðar í sama sýninu og á sama stað og áður hefur verið greint frá.
Lykiláskorunin í genameðferð í öndunarvegi er áfram nákvæm staðsetning burðaragna á áhugaverðum svæðum og að ná mikilli skilvirkni í flutningi í hreyfanlegu lungum í viðurvist loftflæðis og virkrar slímúthreinsunar.Fyrir LV-bera sem ætlaðir eru til meðhöndlunar á öndunarfærasjúkdómum í slímseigjusjúkdómum hefur lenging dvalartíma burðaragnanna í leiðandi öndunarvegi hingað til verið óviðunandi markmið.Eins og bent er á af Castellani o.fl., hefur notkun segulsviða til að auka ummyndun kosti umfram aðrar genasendingaraðferðir eins og rafporun vegna þess að hún getur sameinað einfaldleika, hagkvæmni, staðbundna afhendingu, aukna skilvirkni og styttri ræktunartíma.og hugsanlega minni skammtur af burðarefni10.Hins vegar hefur in vivo útfellingu og hegðun segulmagnaðir agna í öndunarvegi undir áhrifum ytri segulkrafta aldrei verið lýst og í raun hefur ekki verið sýnt fram á getu þessarar aðferðar til að auka genatjáningu í ósnortnum lifandi öndunarvegi.
In vitro tilraunir okkar á PCXI synchrotron sýndu að allar agnirnar sem við prófuðum, að undanskildum MP pólýstýreninu, voru sýnilegar í mynduppsetningunni sem við notuðum.Þegar segulsvið er til staðar mynda segulsvið strengi, lengd þeirra er tengd tegund agna og styrk segulsviðsins (þ.e. nálægð og hreyfingu segulsins).Eins og sést á mynd 10 myndast strengirnir sem við fylgjumst með þegar hver einstök ögn verður segulmagnuð og framkallar sitt eigið staðbundna segulsvið.Þessi aðskildu svið valda því að aðrar svipaðar agnir safnast saman og tengjast hópstrengshreyfingum vegna staðbundinna krafta frá staðbundnum aðdráttarafl og fráhrindingu annarra agna.
Skýringarmynd sem sýnir (a, b) keðjur agna sem myndast inni í vökvafylltum háræðum og (c, d) loftfylltan barka.Athugið að háræðar og barki eru ekki dregnir í mælikvarða.Spjaldið (a) inniheldur einnig lýsingu á MF sem inniheldur Fe3O4 agnir sem eru raðað í keðjur.
Þegar segullinn færðist yfir háræðið náði horn agnastrengsins mikilvægum þröskuldi fyrir MP3-5 sem inniheldur Fe3O4, en eftir það hélst agnstrengurinn ekki lengur í upprunalegri stöðu heldur færðist meðfram yfirborðinu í nýja stöðu.segull.Þessi áhrif eiga sér líklega stað vegna þess að yfirborð glerháræðsins er nógu slétt til að leyfa þessari hreyfingu að eiga sér stað.Athyglisvert er að MP6 (CombiMag) hegðaði sér ekki á þennan hátt, kannski vegna þess að agnirnar voru minni, með aðra húðun eða yfirborðshleðslu, eða séreignarvökvinn hafði áhrif á hreyfigetu þeirra.Andstæðan í CombiMag agnamyndinni er einnig veikari, sem bendir til þess að vökvinn og agnirnar geti verið með sama þéttleika og geti því ekki auðveldlega færst í áttina að hvor annarri.Agnir geta líka festst ef segullinn hreyfist of hratt, sem gefur til kynna að segulsviðsstyrkurinn geti ekki alltaf sigrast á núningi milli agna í vökvanum, sem bendir til þess að segulsviðsstyrkurinn og fjarlægðin milli segulsins og marksvæðisins ætti ekki að koma sem óvart.mikilvægt.Þessar niðurstöður benda einnig til þess að þó seglar geti fanga margar öragnir sem streyma í gegnum marksvæðið, þá er ólíklegt að hægt sé að treysta á seglum til að færa CombiMag agnir eftir yfirborði barkans.Þannig komumst við að þeirri niðurstöðu að in vivo LV MF rannsóknir ættu að nota truflanir segulsvið til að miða líkamlega á ákveðin svæði í öndunarvegstrénu.
Þegar agnirnar hafa borist inn í líkamann er erfitt að bera kennsl á þær í samhengi við flókinn hreyfanlegan vef líkamans, en greiningargeta þeirra hefur verið bætt með því að færa segulinn lárétt yfir barkann til að „hreyfa“ MP strengina.Þó rauntímamyndataka sé möguleg er auðveldara að greina hreyfingu agna eftir að dýrið hefur verið drepið á mannúðlegan hátt.Styrkur MP var yfirleitt hæstur á þessum stað þegar segullinn var staðsettur yfir myndsvæðinu, þó að sumar agnir hafi yfirleitt fundist neðar í barka.Ólíkt in vitro rannsóknum er ekki hægt að draga agnir niður í barka með hreyfingu seguls.Þessi niðurstaða er í samræmi við hvernig slímið sem hylur yfirborð barkans vinnur venjulega að innönduðum ögnum, fangar þær í slímið og hreinsar þær í kjölfarið í gegnum úthreinsunarbúnaðinn fyrir slímhúð.
Við gerðum þá tilgátu að með því að nota segla fyrir ofan og neðan barkann til aðdráttarafls (mynd 3b) gæti það leitt til einsleitara segulsviðs, frekar en segulsviðs sem er mjög einbeitt á einum stað, sem gæti leitt til jafnari dreifingar agna..Hins vegar, frumrannsókn okkar fann ekki skýrar vísbendingar sem styðja þessa tilgátu.Að sama skapi leiddi það ekki til þess að fleiri agnir settust á myndsvæðið þegar segulpar var stillt til að hrinda frá sér (mynd 3c).Þessar tvær niðurstöður sýna fram á að uppsetningin með tvöföldum seglum bætir ekki marktækt staðbundna stjórn MP-bendinga og að erfitt er að stilla sterka segulkrafta sem af þessu myndast, sem gerir þessa nálgun óhagkvæmari.Á sama hátt, að stilla seglinum fyrir ofan og þvert yfir barkann (Mynd 3d) jók heldur ekki fjölda agna sem eftir voru á myndsvæðinu.Sumar af þessum óbreyttu stillingum gætu ekki verið árangursríkar þar sem þær leiða til lækkunar á segulsviðsstyrknum á útfellingarsvæðinu.Þannig er ein segulstillingin við 30 gráður (mynd 3a) talin einfaldasta og skilvirkasta in vivo prófunaraðferðin.
LV-MP rannsóknin sýndi að þegar LV-ferjur voru sameinaðar CombiMag og afhentar eftir að hafa verið líkamlega truflaðar í nærveru segulsviðs, jókst flutningsmagn verulega í barka samanborið við viðmið.Byggt á synchrotron myndgreiningarrannsóknum og LacZ niðurstöðum virtist segulsviðið geta haldið LV í barka og fækkað fjölda vektoragna sem fóru strax djúpt inn í lungun.Slíkar umbætur á miðun geta leitt til meiri skilvirkni á sama tíma og þeir draga úr afhentum titrum, ómarkvissri flutningi, bólgu- og ónæmis aukaverkunum og genaflutningskostnaði.Mikilvægt er að samkvæmt framleiðanda er hægt að nota CombiMag ásamt öðrum genaflutningsaðferðum, þar á meðal öðrum veiruferjum (eins og AAV) og kjarnsýrum.